中国荷斯坦牛产奶性状候选基因的遗传效应分析

发布时间：2016-06-12 06:39

第 1 章 绪论

奶产业是农牧业的重要组成部分，同时奶产业的发展水平也是度量一个国家乃至畜牧业发展水平的重要标志。奶产业的健康、可持续发展对于改进城乡居民的饮食结构、增加农民的经济收入、提高全民的身体素质、促进农村产业的结构调整、带动国民相关产业的经济发展等都具有十分重大的意义。通过各项研究表明，遗传育种是提高奶牛生产效率的主要因素。由此可见，良种的选择是奶业发展的基础，是奶业发展的根本动力。相对于国外的育种工作的发展，我国的育种工作开始的较晚。我国育种工作开始于 1985年，开始的标志是中国黑白花（后更名为中国荷斯坦牛）新品种的培育成功。虽然我国育种工作开展的晚，但是国家对于奶业的发展给予了很大力度的支持，尤其是“十一五”和“十二五”国家科技支撑计划中给予奶业项目优先安排。为了尽快摆脱奶业发展需求先于遗传改良技术的局面，需要开展一系列的科研工作。分子数量遗传学开始于 20 世纪 80 年代，它可以使科学研究者们从表型选择到标记辅助选择，最终实现分子育种的目标。目前，可以通过对基因型的选择，实现对遗传标记或重要经济性状相关基因的鉴定，从而实现个体基因组的早期选择[1]。

1.1 奶牛分子育种技术的研究进展

1.1.1 新疆奶牛饲养概况
据2014年中国奶业统计年鉴统计，2013年年底新疆奶牛存栏量为293.78万头，占全国奶牛存栏量的20%；奶类总产量为325.09 万吨，占全国奶类总产量的0.9%；人均占有量为146.8 kg/人，其中城镇居民奶制品消费量为35.6 kg/人[2]。据统计2013年，新疆地区有42个奶牛场共21576头奶牛进行了生产性能测定，测定日平均产奶量是25.14 kg，平均乳脂率3.82%，平均乳蛋白率3.19%，平均体细胞数41.617万个/mL。新疆奶牛以中国荷斯坦牛为主，中国荷斯坦牛存栏77万头，占新疆牛群总存栏量的33%[3]。由新疆奶牛存栏量和奶类总产量与全国存栏量和奶类总产量比值可知，新疆地区奶牛存栏量较高，但是其奶类总产量却较低，同样说明由于新疆地区奶牛生产性能低下，导致奶类总产量低下，需要通过分子育种等手段提高新疆地区奶牛的生产性能。
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1.2 奶牛产奶性状相关基因的研究进展
酰基辅酶A：甘油二酯酰基转移酶1(acyl-CoA：diacylglycerol acyltransferase1，DGAT1)定位于 BAT14 上，是形成乳腺中甘油三酯的关键酶，它能够促进甘油二酯和脂酰-CoA形成甘油三酯[6]。DGAT1 基因上的 K232A 位点由于不同的等位基因而形成不同的脂肪酸组分[7]。Schennink 等[8]发现了 DGAT1 基因上的等位基因 A 与很多不饱和脂肪酸的形成有关，等位基因 A 能够增加 C18 和总不饱和脂肪酸的比率，同时减少饱和 C10，C12，C14 和 C16 的成分，而 DGAT1 基因上等位基因 K 的作用却与此相反，因此，研究者们可以通过分子生物学手段对 DGAT1 不同基因型进行选择从而达到改变牛奶脂肪酸组分、生产出更利于公众健康的不饱和乳脂牛奶。Tantia 等[9]研究结果发现印度奶牛和水牛中 DGAT1 基因只存在等位基因 K，该等位基因对乳脂率、乳脂量和乳蛋白率影响显著。贾晋等[10]研究结果发现 DGAT1 位点多态性对 305 d 产奶量、乳脂量和乳蛋白性状影响显著。张晓东等[11]发现DGAT1基因K232A位点具有多态性并对乳脂率有显著影响，KA 基因型个体的乳脂率比 KK 基因型个体乳脂率低 0.16。卢振峰等[12]在三河牛 DGAT1基因的 K232A 位点多态性研究中发现其 KK 基因型个体的体细胞分最低。因此在奶牛育种中，可以根据不同的育种目标和市场需要，利用 DGAT1 基因对奶牛群体进行标记辅助选择。
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第 2 章 中国荷斯坦牛 SNPs 位点分析

2.1 混池重测序筛选 SNP
2.1.1 试验材料
2.1.1.1 试验动物
本研究混池所用试验群体为 15 头新疆地区中国荷斯坦牛，采用尾静脉采血，EDTA-K2 抗凝，低温带回实验室分装后置于-20 ℃冻存备用。

2.1.1.2 主要试剂和溶液配置
（1）常用试剂D15000+2000（TIANGEN）、ddH2O、十二烷基硫酸钠（SDS）、尿素、二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-NA·2H2O）、氢氧化钠（NaOH）、Nacl、琼脂糖（Agrose）、Tris 饱和酚、Tris 碱、氯仿：异戊醇（24：1）、无水乙醇、溴化乙锭（EB）等购自新疆阜瑞克生物科技有限公司，大部分为进口分装产品。End Repair Contril，End Repair Mix，AMpure XP Beads，Resuspension Buffer，A-Tailing Control，A-Tailing Index，Stop Ligation Buffer，1×TAE Buffer，凝胶纯化试剂盒，PCR Primer Cocktail，PCR Master Mix，6×Loading Buffer，PiocGreen 荧光燃料等购自诺禾致源生物信息科技有限公司。
（2）常用溶液配制溶液配制均以双蒸水为溶剂，溶液的配置参考《分子克隆实验指南》第三版，溶液配置完成后使用高压锅灭菌。灭菌时间为 20 min。
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2.2 采用 MassArray 技术进行基因分型
本研究所用试验群体来自于新疆呼图壁种牛场、乌鲁木齐种牛场和新疆天山畜牧生物有限公司，共计 1130 头中国荷斯坦牛。试验动物采用尾静脉采血，EDTA- K2 抗凝，低温带回试验室分装后置于-20 ℃冻存备用。根据已知 SNP 位点序列信息，使用 Sequenom MassARRAYAssay Design 软件对待测 SNPs 进行引物设计，引物设计中包括 PCR 扩增引物和单碱基延伸引物。引物设计完成后经软件测试可以使用后交由生物公司进行引物合成。共设计 15 对引物，6 个 SNPs由 DNA 混池全基因组重测序结果提供，9 个 SNPs 由中国农业大学中国荷斯坦奶牛全基因筛选结果和最新研究结果提供。
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第 3 章 SNP 位点对中国荷斯坦牛产奶性状遗传效应分析..........45
3.1 材料与方法......45
3.1.1 生产性能数据收集.......45
3.1.2 数据整理.......45
3.1.3 因素水平划分.......45
3.1.4 试验统计软件.......46
3.1.5 数据统计分析.......46
3.2 结果..........47
3.2.1 性状表型记录.......47
3.2.2 SNP 对产奶性状的遗传效应分析...... 48
3.2.4 连锁与单倍型分析.......54
3.2.5 单倍型对产奶性状遗传效应分析.......55
3.3 讨论..........56
3.3.1 SNPs 多态性验证.........56
3.3.2 SNPs 对产奶性状遗传效应分析.........57
3.3.3 连锁不平衡分析...........59
3.3.4 单倍型分析...........59
3.3.4 SNP 基因型分析检测平台.......... 60
第 4 章 结论...... 61

第 3 章 SNP 位点对中国荷斯坦牛产奶性状遗传效应分析

3.1 材料与方法
3.1.1 生产性能数据收集

本试验中所需的生产性能主要包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和体细胞数。生产性能数据由自治区奶业办公室乳品质量检测中心提供。取自 2011-2014 年间呼图壁种牛场、乌鲁木齐种牛场和天山畜牧生物有限公司中国荷斯坦牛的 DHI 测定数据。DHI 测定数据是每月从牛场采样一次，自治区奶业办公室乳品质量检测中心进行检测所得结果，，主要检测项目有乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、总固体和体细胞数等，测定日产奶量由牛场测定记录，报送检测中心。中国荷斯坦牛每头牛完整而详细的胎次和日产奶量等数据资料来自该场的累积记录和现场测量记录，包括父号、母号、出生时间、产犊时间、305 d 产奶量及全期产奶量等。体细胞数的分布频率为偏态分布，在统计分析中许多特性不能使用偏态分布数据进行数据分析，因此需要将数据转换，将偏态的体细胞数转换为正态的体细胞分.场划分按照自然场地进行划分，乌鲁木齐种牛场、天山畜牧生物有限公司和呼图壁种牛场分别采用 1、2、3 代表；产犊年份按照自然年份进行划分；按照新疆气候的特点，将产犊季节分为冬(11-2 月)、春（3-5）夏(6-10 月)3 个季节，分别以数字 1、2、3 表示，划分标准以李金国等[89]人研究结果为主，参考新疆近年来月平均气温进行季节的划分.

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结论

本研究使用 DNA 混池全基因组重测序技术进行 SNPs 的筛选，同时使用 MassArray技术进行基因型分型，对已报道的 SNPs 在新疆地区中国荷斯坦牛的遗传效应进行功能验证，对新发现的 SNPs 对产奶性状遗传效应进行分析。得到以下结果：
1.通过 DNA 混池全基因组重测序得到大量的 SNPs，通过对 SNP 位点的筛选并根据MassArray 技术检测要求，最终选取 6 个 SNPs 进行下一步分型试验，6 个 SNPs 均属于非同义变异，并属于首次发现的 SNPs。
2.将由 MassArray 技术的到分型结果与产奶性状遗传效应进行分析，发现 6 个 SNPs与产奶性状有显著影响，2 个 SNPs 与产奶性状有极显著影响。
3.采用 Haploview 软件对 SNPs 进行连锁及单倍型分析，共发现 3 个单倍型模块，3个单倍型模块间连锁程度较低，不同的单倍型对产奶性状均有显著性影响。
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参考文献(略)

本文编号：56307