玉米雌穗发育相关miRNAs靶基因的降解组分析

发布时间：2016-06-29 22:08

1.文献综述 

1.1我国玉米发展简史 
玉米(Zea may L.)原产于南美洲，在美洲已经有7000多年的种植历史。由于玉米适合旱地种植，西欧殖民者侵入美洲后将玉米带到欧洲，之后在亚洲和欧洲被广泛种植，大约在十六世纪中期，中国开始种植玉米  [1]。 玉米传入中国后，在相当长的一段时期主要供作备荒济贫而栽培的粮食作物，耕作粗放，品种退化，产量偏低，发展缓慢。直到20世纪现代科学的兴起之后，玉米生产才有了较快的发展。20世纪中国玉米生产发展大致可分为5个阶段[1]：第一阶段，1900-1936年，适应人口增长和对粮食的需要，玉米逐步遍植全国各地。第二阶段，1937-1948年，战乱频繁，人口迁徙，生产力遭受破坏。为适应战争需要，玉米在西南、华北和西北等局部地区有一定的发展。第三阶段，1949-1978年，随着人口急剧增长和满足粮食需求，玉米作为高产作物被放在重要位置，一般在不适宜种植水稻和小麦的地区，均大力发展玉米，形成了我国南北四季种植的玉米带。第四阶段，1979-1990年，在改革开放的新形势下，随着科技进步和物质投入的增加，特别是确立玉米在饲料中的主导地位，玉米生产稳步发展。我国从20世纪70年代开始在生产上推广单交种，经过五次品种更新换代，品种已成为我国玉米增产的最重要的因素之一。20世纪中国玉米研究从无到有、从浅入深、从发展到提高并取得重大成绩，主要包括品种改良、种质创新、耕作栽培、病虫防治、种子产业等几个方面。20世纪90年代，玉米发展成为重要的粮、饲、经兼用作物，2012年玉米总产量上已经超过稻谷，成为中国第一大粮食作物。 20世纪以前，玉米多作为理想的模式植物被用来做遗传学研究[2]。1876年达尔文以自己的实验结果，首先报道了自交和杂交对玉米生长的显著差别。1880年W.J. Beal最早用隔离区和摘除雄穗的方法产生了玉米品种间杂交的种子。Shull进行的玉米粒行数的遗传研究，揭示了玉米自交系导致衰退、杂交产生生长优势的现象，并在1908年和1909年发表文章提出超显性学说，从而奠定了近代玉米育种方法的基础。1918年Jones建议在生产上改用双交种种子，大大推动了玉米杂种优势在生产上的应用。 
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1.2玉米雌穗发育研究 
在玉米的整个生育期中，雌穗的发育对产量形成尤其重要，对玉米雌穗的研究不仅有重要经济价值，也有重要的生物学意义。自十九世纪中叶开始，到二十世纪初，除了玉米生理学和解剖学方面的研究外，对有关花序及小花的个体发育的形态特征，以及对子房、柱头、胚珠的形态解刨等方面的研究，不断取得进展。Kempton 在 1913 年首次明确提出了玉米雌性花序中小穗双性的问题。Weatheruax 根据大量玉米变种的观察，对雌性花进行了详细的分析，认为玉米的雄花和雌花都是完全花，雌花在母细胞形成以前保留有发育不完全的雄性成分，而雄花中雌性成分的退化时间相对要早，这也说明了玉米早起发育阶段雄性和雌性小穗的同源性。Bonnet 进一步指明了雄穗和雌穗以及小花的发育过程。在大量参阅国内外有关文献的基础上，1978～1981 年，北京农林科学院以京早 7 号、京早 107 和京黄 113 等品种为试验材料，作不同播期处理，研究玉米雌穗分化过程，，提出了玉米雄雌穗每一时期的分化过程及形态特征。 玉米雌穗的分化时间比雄穗分化较晚，大约晚 10 天左右时间。其分化过程可分为：生长锥未伸长期、生长锥伸长期、小穗分化期、小花分化期、性器官形成期。1）生长锥未伸长期：生长锥尚未伸长，呈现基部宽度大于长度的圆锥体。生长锥下面已经分化出节和缩短的节间，将来成为果穗柄，每节上有也原始体，以后发育成包叶。2）生长锥伸长期：生长锥显著伸长，长度大于宽度（图 1-1），随后在生长锥基部出现分节和叶凸起，在这些叶突起的叶腋间将形成小穗原基，以后叶突起消失。3）小穗分化期：生长锥继续伸长，出现小穗原基（图 1-2，1-3），每个小穗原基又迅速分裂为两个小穗突起，形成两个并列小穗，并在它的基部出现褶皱状的突起，将来发育成颖片。 4）小花分化期：每个小穗突起进一步分化成大小不等的两个小花突起。大的在上，生长较快，发育成结实的小花；小的在下，生长缓慢，不久萎缩，成为不孕小花。在小花原基外围，形成三角形排列的三个雄蕊原基，中间分化出一个扁圆形隆起的雌蕊原基，随后雄蕊原基生长减慢，最后消失，而雌蕊原基迅速增大（图 1-4，1-5）。 
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2.引言 

玉米目前已是我国第一大粮食作物，主要用途为粮用、饲用和工业原料。玉米产业的蓬勃发展主要依赖于人们生活水平的提高，玉米在饲料用途上地位的不断加强，以及国家对农业科技的投入的不断增强。玉米的生产安全在很大程度上也就决定了国家的粮食安全。而在玉米的生产过程中，玉米植株雌穗的生长发育对玉米的产量形成具有决定性的作用，研究玉米雌穗发育及其调控过程具有重要的经济学和生物学意义。 MicroRNAs（miRNAs）是一类具有 20～24nt 序列长度的非蛋白质编码的内源小分子RNA，这种非编码 RNA 在动物、植物和微生物中高度保守，在转录和转录后水平调节基因的表达。近几年研究发现，miRNA 在动植物细胞的个体发育、逆境胁迫、物质代谢、发育调节、活性氧清除等生命过程中担当着重要的角色，相关 miRNA 的基础研究为人们认识生物基因及其表达调控的本质提供了一个全新的角度。随着 miRNA 研究相关实验技术的进步以及生物信息学技术的发展，玉米 miRNA 的分离、靶基因的筛选及功能鉴定等方面的研究成为玉米分子生物学研究的热点。 目前对于玉米雌穗的研究多数集中在玉米授粉后籽粒形成的生理及分子水平上，对雌穗发育阶段早期的研究较少，在玉米雌穗发育早期阶段，从生长锥开始形成一直到花器官形成，这一阶段的雌穗发育对玉米小穗的形成至关重要。本研究采用降解组测序的方法，对玉米雌穗发育早期阶段，从 miRNA 水平，鉴定参与玉米雌穗发育相关 miRNA 及其靶基因，为进一步研究玉米雌穗发育相关过程奠定基础。 
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3.材料与方法 .......... 10 
3.1 主要仪器设备及耗材 .... 10 
3.2 植物材料和 RNA 的准备 ....... 11 
3.2.1 实验样品总 RNA 的提取 ......... 11 
3.2.2 RNA 质量检测 .... 12 
3.3 全基因组 degradom 测序 ..... 12 
3.3.1 降解组测序原理 ....... 12 
3.3.2 降解组测序文库的构建 ......... 13 
3.3.3 数据分析.... 13 
3.4 miRNA 及靶基因表达谱构建 ...... 14 
4.结果与分析 .......... 19 
4.1 miRNA 序列基本信息 .... 19
4.2 t-plot 图 ........ 19 
4.5 新型 miRNA 及其靶基因预测 ...... 27 
5.结论与讨论 .......... 28 
5.1 结论 ..... 28 
5.2 讨论 ..... 28 

4.结果与分析 

4.1 miRNA 序列基本信息 

测序总共得到 175214241 次原始读数。每个样品平均获得 19468249 读数，范围从17410285 到 22869631。除筛选接头序列和短于 18nt 的序列后还有 168052273 次读数，每个样品平均 18672474 次净读数，范围从 16909865 到 22244845。所有其他类型的小 RNA 筛除后，还有共138600762 次候选 miRNA读数，每个样品平均15400084 次读数，范围从11902891到 19538721。候选的 miRNA 与玉米 B73 基因组（RefGen_v2）比对，在所有的样品中，21 nt 的 RNA 最丰富，占总量 61.60％；其次是 19nt，占总量 15.51％，这些 miRNA 代表玉米穗成熟的 miRNA 的典型长度（图 4）。为了更直观的展示所检测到的 miRNA 相对于的靶基因的关系，我们构建了玉米雌穗发育相关 miRNA 与对应靶基因的 t-plot 图（图 5）。 玉米雌穗发育相关 miRNAs 切割靶基因的分类类型 Category 值基本为 0 和 1。zma-miR167a 的靶基因为 GRMZM2G078274-T03，基因片段长度为 3199  nt，切割作用发生在该 mRNA 的第 2542 位上。在该位点上产生的切割片段 reads 数约为 100 个，并且 miRNA和靶基因之间的匹配分数为 4，意味着配对程度很高，几乎完全配对，并且是属于 0 型。zma-miR164a 的靶基因为 GRMZM2G063522-T01，基因片段长度 1534nt，切割作用发生在该 mRNA 的第 905 位上。在该位点上产生的切割片段 reads 数约为 5 个，miRNA 和靶基因之间的匹配分数为 2，并且是属于 1 型。说明原始数据片段在该位置，丰度等于该转录 RNA上的丰度最大值，并且不只一个丰度最大值。 

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结论 

利用我国玉米优良杂交种郑单958的亲本自交系昌7-2和郑58作为试验材料，运用降解组测序等技术，获得了玉米雌穗发育相关的miRNA及其靶基因。结合实时荧光定量PCR（Real-time PCR）对玉米雌穗发育相关的重要miRNA和其靶基因进行表达分析验证，得到以下结论： 1.进行Illumina测序后总共得到175214241次原始读数。每个样品平均获得19468249读数。除筛选接头序列和短于18nt的序列后还有168052273次读数，每个样品平均18672474次净读数，范围从16909865次到22244845次读数。所有其他类型的小RNA筛除后，还有共138600762次候选miRNA读数，每个样品平均15400084次读数，范围从11902891次到19538721次读数。候选的miRNA与玉米B73基因组（RefGen_v2）比对，在所有的样品中，21 nt的RNA最丰富，占总量61.60％；其次是19nt的片段，占总量15.51％。 2.将targetfinder中miRNA序列与mRNA序列的配对预测结果和降解组密度文件的结果相结合进行靶基因的精确预测，共发现16个miRNA家族的95个miRNAs对应47个靶基因。 3.47个靶基因进行了Gene Ontology(GO)分类，发现处于细胞核和CCAAT结合因子复合体的靶基因占78.5%；参与转录、DNA依赖、转录调控、细胞分化的靶基因占53.2%；与DNA结合、特殊序列DNA结合、金属离子DNA结合的靶基因占72.9%。 4.挑选出7个保守的miRNA及其相应的靶基因利用荧光定量PCR的方法进行表达谱的构建，显现出的结果与测序结果比较一致，表明测序结果的可靠性。 5.根据先前相关的miRNA的研究报道，结合本研究的实验结果，分析差异表达明显的miRNA，表明玉米雌穗发育过程中存在依赖miRNAs调控的代谢通路。  
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参考文献(略)

本文编号：63472