电活性微生物与固体电极间的双向电子转移及其效应研究
第一章 绪论
1.1 引言
在自然环境中，，98%以上的微生物是以附着在固体物质表面的群体性生物膜（Biofilms）形式生长，而不是以单个的浮游态（planktonic）细胞存在(贾文祥，2012)。微生物膜除了具有菌细胞群体外，还包含粘附于非生物或生物表面由微生物产生的胞外聚合物(主要为胞外多糖，蛋白质和胞外核酸等)组成的复杂三维基质网结构。与浮游态细菌相比，生物膜形态的细菌具有以下优势：（1）膜结构的屏障作用使其对环境的变化具有更强的抵抗能力，如约 60%的人体持续性细菌感染部位的耐药性和抗机体免疫反应能力与组织或器官表面的细菌生物膜结构形成有直接关系（Costerton et al., 1999）；（2）生物膜内的细菌代谢强度低，存活时间更长；（3）细胞间可进行密切而广泛的信息交流和通讯活动。同时，微生物与固体之间的相互作用是一个最基本的生物地球化学过程，对整个地球环境的变化都有重要影响。例如，微生物与土壤矿物的相互作用，如矿物的溶解、金属离子还原沉淀、物质交换等，对于表层矿物结构的进化起了关键作用。然而，多年来，微生物学家对细菌的认识主要局限于单个浮游态的细胞研究，而对群体性微生物膜结构及其与固体的界面相互作用的认识则远远不足。传统的微生物膜理论认为，微生物与固体间的相互作用主要包括简单的吸附/解吸行为、分解矿化、微生物腐蚀、溶解/沉淀等反应过程。伴随着电活性微生物（Electroactive Bacteria, EABs）的分离和生物膜学（Biofilmology）的发展，研究者开始认识到微生物与固体间可进行直接的电子交换反应。这一认识极大地吸引了人们对微生物电化学行为的关注和研究兴趣，导致了电化学微生物学（Electromicrobiology）、电生物地球化学（Electrobiogeochemistry）等新学科的兴起。电活性微生物与固态电子受体/供体(固体腐殖质、铁氧化物、电极、天然导电矿物)的相互作用及电子传递机制也逐渐成为环境微生物领域的研究热点。2010 年 1 月，EST 发表“Biogeochemical Redox Processes”热点专刊，指出电活性微生物的“胞外呼吸”是厌氧环境中的控制性电子转移途径，直接驱动了 C/N/S 等关键元素的生物地球化学循环过程”。
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1.2 电活性微生物
通常将具有胞外呼吸功能的微生物称之为电活性微生物。所谓胞外呼吸，是指在厌氧条件下能够将有机物氧化产生的电子跨膜传递至胞外电子受体或电子反向传递至胞内的过程。其本质是微生物代谢获取能量的一种方式。胞外呼吸是相对于传统的胞内呼吸而言的。胞内呼吸的电子受体（氧、硝酸盐、延胡索酸盐等）一般通过扩散等方式进入细胞内，电子传递及还原反应在细胞内完成。而胞外呼吸的电子受体（如活性炭、铁氧化物）通常则不能进入细胞，只能在胞外被还原。故胞外呼吸可看成是细菌电子传递链延长至细胞膜外的结果。电活性微生物这一概念是近十年来伴随微生物燃料电池（Microbial fuel cells, MFC）的发展而产生的。不过，早在 20 世纪初，英国植物学家 Potter 发现酵母和大肠杆菌培养液在降解有机物的同时可以产生电流（Potter et al., 1911）。这一研究首次暗示了电活性微生物的存在，并由此揭开了微生物燃料电池的研究序幕。 MFC 是一种利用微生物胞外呼吸功能将化学能转换为电能的装置。电活性微生物是影响 MFC 性能的重要因素。尽管 MFC 已有一百多年的历史，早期的MFC 由于产电效率低、稳定性差而一直处于研究低谷乃至停滞。直到 1980 年以后，各种外源电子传递穿梭体（如中性红、Fe(III)EDTA 等）引入 MFC 后，MFC 产电性能才有了较大的提升(Vega et al., 1987)。然而这些外源电子穿梭体的价格昂贵、容易流失或具有毒性等问题仍然限制了其在 MFC 的应用。2005年，美国学者 Bruce Logan 教授提出将有机废水处理和微生物发电的技术相结合，即 MFC 利用废水中的有机物为底物产生电能的概念，给 MFC 的研究注入了新的活力，引起了国内外学者的高度关注(Logan et al., 2005a)。与其他非生物型燃料电池相比，MFC 最大的特点就是电活性微生物在该过程中发挥了催化剂的作用，可以取代昂贵的化学催化剂（如铂等），因而使得该技术具有操作条件温和、节省能源、转化效率高、环境友好等优势。此外，MFC 的燃料来源具有多样性。理论上所有可微生物降解的有机物都可作为 MFC 的燃料，MFC 在处理有机废物的同时产生电能，相比传统的耗能污水处理工艺可有效降低运行成本，因此利用废水有机污染物产电具有非常广阔的应用前景(Logan et al., 2005b)。
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2.1 引言
生物炭是由生物质(如木材、农作物秸秆、污泥等)在缺氧或无氧的条件下，经高温慢热解产生的一类富含碳素的固体材料(Lehmann et al., 2011)。它主要由芳香环和单质碳或类石墨结构的碳组成，通常含有 60%以上的碳元素。生物炭制备工艺相对简单，原料来源广泛，价格低廉，并同时具有多种优异的理化特性，包括孔隙多、比表面积大、容重小、吸附能力强、稳定性高、偏碱性，因而在全球气候变化、环境污染修复、能源短缺、粮食危机和农业可持续发展生态污染等方面具有潜在的应用价值和前景(Woolf et al., 2010; Ghani et al., 2013)。在过去短短几年内，生物炭已经成为农业与环境科学领域的研究热点，但主要集中在固碳作用、吸附行为、生物能源、土壤改良剂等方面。例如研究人员估算生物炭可在土壤中保存几百年乃至几千年，是极为稳定的碳固定载体，将不稳定碳转化为芳香性碳骨架封存于土壤中，有望缓解全球气候变暖(Singh et al., 2012)。同时生物炭还可抑制温室气体的排放(Case et al., 2014)。生物炭可用来作吸附剂去除污水中重金属和有机污染物，还可作为稳定剂钝化封锁土壤中污染物(Cao et al., 2011)。将生物炭添加于土壤中可改善土壤的理化性质，从而提高农作物产量(Alburquerque et al., 2013)。生物炭在制备的过程中还可获得生物质能源及化学品，可以节省化石能源，并且降低化石原料的碳排放。目前对生物炭应用于土壤后对环境污染物生物转化的影响研究仍相对薄弱。 一般认为，碳质材料对污染物的吸附作用降低了其生物可利用性，对污染物起了隔离和封存作用，不利于污染物的降解(Tang et al., 2011)。而材料自身的一些理化性质可能又具有加速吸附态污染物化学或生物转化的潜力，使得其对污染物的转化和命运的影响变得错综复杂。例如 Frank 等首先报道活性炭可以作为氧化还原反应电子穿梭体介导并加速污泥微生物对酸性橙和杂氮反应红的还原降解(Van Der Zee et al., 2003)。生物炭作为新兴的一类具有巨大应用潜力的碳质材料，不仅具有与活性炭类似的强大的污染物吸附能力，而且还可以同时具备良好的物理导电性和较多的表面基团，当其广泛应用后对环境污染物的生物转化和命运起着怎样的作用尚不清楚，仍有待进一步研究。
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2.2 材料和方法
Geobacter sulfurreducens PCA （ DSM12127 ）购买于德国菌种保藏中心（DSMZ）。Geobacter sulfurreducens 初始培养基为 NBAF（p H = 7.0），具体配方见表 2-1 至表 2-4。 实验所用水稻秸秆 (Rice straw) 来源于广州华南植物园稻田，椰子壳(Coconut shell)采集于水果市场。自来水清洗泥土、灰尘等杂质后，将水稻秸秆的穗部、叶子和根部去除，剩下茎秆部分剪成 2-3 cm 长左右的小片段，同时将椰子壳切成均匀小块，分别放置在烘箱中 80 °C 烘干。将准备好的水稻秸秆和椰子壳分别装入石英管（长 1.2 m，内径 7 cm）后，管口密封并通入氮气（1.5 L/min），然后置于电阻炉上以 20 °C /min 的速率加热至某一恒定的温度（例如900 °C）并维持 1 h。冷却至室温后，将所得的炭化固体研磨成约 0.15 mm 大小的碳颗粒，并过 100 目筛子，干燥器中贮存备用。根据炭化温度，将不同材料及温度制备的生物炭分别定名为 BCX（秸秆生物炭）和 YBX（椰壳生物炭），其中 X 代表炭化温度。例如 BC400 是指 400 °C 炭化的秸秆生物炭。
第三章 电活性生物膜对电极电子的吸收及脱氮效果..........57
3.1 引言 ....... 57
3.2 材料与方法 ...... 58
3.3 结果与讨论 ...... 66
3.3.1 粪产碱杆菌和脱氮硫杆菌生物膜的扫描电镜表征 ......... 66
3.3.2 粪产碱杆菌和脱氮硫杆菌生物膜的电化学特性 ............. 68
3.3.3 粪产碱杆菌生物膜对电极电子的吸收及脱氮效果 ......... 71
3.3.4 脱氮硫杆菌生物膜对电极电子的吸收及脱氮效果 ......... 75
3.3.5 脱氮硫杆菌的电子输入机制研究 .... 77
3.4 本章小结 .......... 80
第四章 电活性生物膜固定 CO2电合成有机物研究 .............81
4.1 引言 ....... 81
4.2 材料和方法 ...... 82
4.3 结果与讨论 ...... 88
4.4 本章小结 ........ 102
第五章 粪产碱杆菌与固体电极间的双向电子转移及机制...........103
5.1 引言 ..... 103
5.2 材料与方法 .... 104
5.3 结果与讨论 .... 108
5.4 小结 .... 137
第五章 粪产碱杆菌与固体电极间的双向电子转移及机制
5.1 引言
电活性微生物胞外电子转移涉及微生物与胞外氧化还原固体之间的直接电子流动和交换(Yang et al., 2015)。这既包括从细胞内至胞外固体的电子输出，也包括电子从胞外传递至胞内的输入过程，分别对应于微生物燃料电池的阳极反应和阴极反应。电活性微生物胞外电子的双向转移（输出和输入）具有同等重要的应用潜力，其电子输出可用来生产电能、合成金属纳米颗粒、废水有机物氧化降解等(Logan et al., 2012)。而电子输入过程则可用于电合成生物燃料、污染物还原降解等(Sharma et al., 2013)。 尽管人们已经从各种环境中分离了大量不同种类的 EABs，大多数对 EABs电子跨膜传递机制的研究主要局限于 G. sulfurreducens 和 S. oneidensis MR-1 等几种主要模式菌，而对其他 EABs 电子跨膜传递机制的认识和研究仍十分不足。更重要的是，这些研究大多偏向于阐明胞外呼吸电子的输出机制，而胞外电子输入机制的研究和认识则较为欠缺。研究 EABs 的双向电子传递机制，对于全面理解 EABs 在不同环境条件的环境化学行为及效应、提升其应用潜力具有重要意义。 目前 S. oneidensis MR-1 的双向电子转移机制已经取得了较大进展(Coursolle et al., 2010; Jiao et al., 2011; Sydow et al., 2014)。在电子输出时，S. oneidensis MR-1 采用的是 Mtr 传递途径，呼吸电子依次从 NADH（胞内电子载体）流向甲基萘醌池（menaquinonepool）、Cym A(内膜 c 类型四血红素基团色素蛋白，c-Cyts)、Mtr A(周质空间 c-Cyts)和外膜跨膜蛋白 Mtr B，最终经外膜 Mtr C和 Omc A 传递给胞外电子受体如电极(Yang et al., 2015)。而在电子输入时，S. oneidensis 菌可以利用逆向的 Mtr 电子传递途径进行胞外电子的吸收和传递(Ross et al., 2011; Okamoto al., 2014; Sydow et al., 2014)。但 Geobacter 菌在电子输入时采用了不同于电子输出的电子转移途径(Strycharz et al., 2011)。
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结论
本文以四种电活性微生物(硫还原地杆菌、粪产碱杆菌、脱氮硫杆菌和嗜热自养梭菌)为研究对象，以胞外电子输出/输入为主线，分别从五氯酚还原脱氯、硝酸盐还原脱氮和二氧化碳还原（电合成有机物）等方面研究了微生物与固体电极之间双向的电子转移过程及其效应，并探讨了其可能的电子转移机制，得到以下结论：
（1）秸秆和椰壳生物炭可用作 G. sulfurreducens 生长的电子受体，生物炭电子接受容量越高，G. sulfurreducens 生长量越大。秸秆生物炭能够发挥固态电子穿梭体的功能介导电子从 G. sulfurreducens 到五氯酚(PCP)的转移，从而加速PCP 的还原脱氯。但不同温度制备的秸秆生物炭介导活性差异较大。降解动力学和生物炭表面修饰等结果表明，秸秆生物炭介导 PCP 还原脱氯的活性与其电子交换容量和导电性均有密切关系，证明生物炭以表面氧化还原基团和导电性石墨区域结构两种途径来介导电子从 G. sulfurreducens 到 PCP 的转移机制。
（2）A. faecalis 和 T. denitrificans 生物膜均具有吸收碳布电极的电子进行自养脱氮作用的功能。电极电位越负，两种生物膜的脱氮速率越高。A. faecalis生物膜的脱氮效率(氮去除率 71.6%)明显高于 T. denitrificans(氮去除率 17.8%)。前者以脱氮(Denitrification)和异化硝酸盐还原为氨两种途径进行硝酸盐还原，而后者不存在异化硝酸盐还原为氨途径。原位红外光谱证实 T. denitrificans 外膜氧化还原状态发生了改变，证明其外膜具有电化学活性基团。电子传递抑制剂实验表明 T. denitrificans 吸收的电极电子跨细菌外膜后传递到了质膜上的复合物I、II、III 及醌池，最终传递给脱氮酶。在电子传递至胞内过程中，T. denitrificans将产生的能量贮存至 ATP。
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参考文献(略)
本文编号：84517
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/lwfw/84517.html
