彭水县科委科研项目_黄芪甲苷对人皮肤成纤维细胞增殖和凋亡的影响

发布时间：2016-11-15 02:08

  本文关键词：四川省科委科研基金，由笔耕文化传播整理发布。

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?实验研究?

黄芪甲苷对人皮肤成纤维细胞增殖和凋亡的影响

王曦石钰Ｃ．Ｖｉｅｎｎｅｔ李利Ｐ．Ｈｕｍｂｅｒｔ

探讨黄芪甲苷对体外培养的有皱纹、无皱纹中老年人皮肤成纤维细胞生物学特性

【摘要】目的

的影响。为黄芪甲苷用于延缓皮肤衰老和皱纹形成提供细胞水平的客观依据，为进一步探讨皮肤衰老机制和开发抗衰老护肤品提供新思路。方法体外培养中年人眼角皱纹与眼角无皱纹皮肤深处成纤维细胞；老年人面颊皮肤成纤维细胞。加入不同浓度的黄芪甲苷，干预２４、７２、１２０ｈ后，检测黄芪甲苷对这３例皮肤成纤维细胞系增殖活性、Ｉ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、弹性蛋白合成和凋亡率的影响。结果黄芪甲苷在较低浓度（５～２０／－ｇ／ｍ１）时可促进皱纹和无皱纹皮肤成纤维细胞增殖，促进皱纹、无皱纹和老年皮肤成纤维细胞Ｉ型胶原蛋白合成，降低皱纹和无皱纹皮肤成纤维细胞凋亡率（Ｐ＜Ｏ．０１）。结论芪甲苷在较低浓度时具有改善皱纹和非皱纹皮肤成纤维细胞生物学特性的作用。

【关键词】黄芪甲苷；

成纤维细胞；

黄

细胞培养；增殖；凋亡

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（Ｐ＜Ｏ．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ

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Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ；Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；

Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ

皮肤成纤维细胞衰老及生物学特性改变是导致皮肤老化皱纹出现的重要原因。黄芪为豆科植物膜荚黄芪或内蒙黄芪的干燥根，其活性成分具有延缓衰老的作用。黄芪甲苷是黄芪的主要有效单体成分，但关于黄芪甲苷抗衰老的实验研究很少，我们通过体外培养人皮肤成纤维细胞，观察黄芪甲苷对体

外培养的有皱纹、无皱纹和老年皮肤成纤维细胞生物学特性的影响，为黄芪甲苷用于延缓皮肤衰老及皱纹的形成提供实验依据。

材料与方法

一、材料

１．主要试剂及设备：新生小牛血清，ＤＭＥＭ培养液、混合胶原酶（Ｇｉｂｃｃ，美国）；四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ，Ｓｅｒｖａ公司）；兔抗人工型胶原抗体、兔抗人Ⅲ型胶原抗体、小鼠抗人弹性蛋白抗体、小鼠抗人波形蛋白抗体、即用型ＳＡＢＣ试剂盒，均购自武汉博

士德；细胞凋亡试剂盒（北京中山）；黄芪甲苷标准品

基金项目：四川省科委科研基金资助项目（编号：０２ｓｙ０２９—１４９）作者单位：６１００４１成都，四川大学华西医院皮肤性病科［王曦（Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉｅｒｗａｎｇ＠１２６．ｃｏｒｎ）、石钰、李利］；ＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅｄＩｎｇｅｎｉｅｒｉｅ

ｅｔ

ｄｅ

Ｂｉｏｔｏｇｉｅ

Ｃｕｔａｎｅｅｓ，ＵＦＲＭｅｄｅｃｉｎｅ—Ｐｈａｒｍａｃｉｅ，２５０３０Ｂｅｓａｎｃｏｎ，

Ｆｒａｎｃｅ（Ｃ．Ｖｉｅｎｎｅｔ，，Ｐ．Ｈｕｍｂｅｒｔ）

通讯作者：李利，６１００４１成都，四川Ｉ大学华西医院皮肤性病科

（Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｅｒｙｉｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ）

生堡匡堂苤堂差窒苤壶！！！！生！旦箜！！鲞笙！塑￡！也』丛笪垒！壁垒坠ｇ！！坐堕！』！些！！！！！ｙ！！：！！！盟！：；

（中国药品生物制品检定所）；二氧化碳孵箱；ＴＥ２０００一Ｕ倒置生物显微镜（Ｎｉｋｏｎ）；流式细胞仪（Ｃｏｕｌｔｅｒ，美国）。

２．标本来源：中年男性眼角皱纹皮肤１例（４７岁），中年男性眼角无皱纹皮肤１例（３９岁），老年男性面颊皮肤１例（７５岁）。均来源于我院皮肤科门诊手术室。

二、方法

１．建立人皮肤成纤维细胞系：皮肤标本用胶原酶消化、分离成纤维细胞，置ＣＯ。孵箱中培养并传代，建立３例人皮肤成纤维细胞系，实验用３～６代细胞。

２．制备黄芪甲苷液体：取０．１ｇ黄芪甲苷溶于

ｌ

ｍｌ二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），配成浓度为ｉ００ｍｇ／ｍｌ

的贮存液，临用时用ＤＭＥＭ培养液倍比稀释，使其终浓度分别为２０（０．０２％ＤＭＳＯ）、１０（ｏ．０１％ＤＭ—ＳＯ）、５肛ｇ／ｍｌ（０．００５％ＤＭＳＯ，其浓度≤１％时，对细胞增殖的影响与细胞对照组比较无差异）。

３．细胞鉴定：（１）形态学观察：将成纤维细胞用０．２５％胰酶消化，制成单细胞悬液，接种于含盖玻片的６孔板中，置ＣＯ：孵箱培养１～２ｄ，待细胞长成单层，取出长有细胞的盖玻片，９５％乙醇固定，ＨＥ染色，镜下对比观察细胞的形态特征。（２）免疫组织化学鉴定：取上述细胞爬片，９５％乙醇固定，免疫组织化学测定细胞工型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白，波形蛋白和角蛋白表达的情况。

４．ＭＴＴ法测成纤维细胞增殖：制备单细胞悬液，接种于９６孑Ｌ板上。分别加入黄芪甲苷２０、１０、５肚ｇ／ｍｌ，同时根据ＤＭＳＯ的浓度做相应溶剂对照，每例细胞的每一药物浓度孑Ｌ及相应溶剂对照孔均做４复孔。另做１孔不加细胞，只加培养液和中药（比色时用此孔调零）。共做３块培养板。培养２４、７２、

１２０

ｈ时各取出１块培养板，ＭＴＴ法检测各孔光吸

收值（Ａ５７０ｎｍ）。

５．胶原蛋白和弹性蛋白测定：根据ＭＴＴ法检测结果，选择１个作用最明显的黄芪甲苷浓度。将细胞接种于２４孔板中，每例细胞分２组，１组加黄芪甲苷，浓度１０／，ｇ／ｍｌ，另１组用相应浓度的ＤＭ—ＳＯ（０．０１％）作溶剂对照，每组均做３复孔。共做３块培养板。培养２４、７２、１２０ｈ时各取出１块培养板，免疫组织化学法测工型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和弹性蛋白合成。．

６．细胞凋亡检测：依据ＭＴＴ法检测结果，结合免疫组织化学检测结果选择１个作用最明显的黄芪

甲苷浓度和时间。将细胞接种于６孔板中。每例细胞分两组，１组加入黄芪甲苷，浓度为１０ｕｇ／ｍｌ，另１组用相应浓度的ＤＭＳＯ（ｏ．０１％）作溶剂对照，每组１孑Ｌ，共接种２块板。ＣＯ。培养箱中培养７２ｈ，１

块板用于流式细胞仪检测细胞凋亡率，１块板用于

细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡小体。

７．计算机图像分析：采用Ｉｍａｇｅ—ＰｒｏＰｌｕｓ专业图像分析软件系统（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，美国），对免疫组织化学标本的结果进行定量分析。本实验选取指标为平均吸光度口矗］。

８．统计学处理：因为每例细胞的每一药物浓度孔及相应溶剂对照孔均为复孔，检测结果取平均值。用ｔ检验比较黄芪甲苷组和ＤＭＳＯ组增殖的

Ａ㈣…蛋白表达的平均吸光度；７２检验分析黄芪甲

苷组和ＤＭＳＯ组的凋亡率。统计处理应用ＳＰＳＳｌｌ．０软件。

结

果

一、３例皮肤成纤维细胞系鉴定

ＨＥ染色，光镜下观察可见皮肤成纤维细胞呈多角形或长梭形，胞浆丰富，胞核较大。免疫组织化学鉴定结果显示：３例成纤维细胞工型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、波形蛋白表达均为阳性，角蛋白表达为阴性（图１～４）。

二、黄芪甲苷对３例皮肤成纤维细胞系增殖的影响

１．皱纹皮肤成纤维细胞：黄芪甲苷浓度为２０ｇｇ／ｍｌ，培养２４ｈ细胞增殖抑制，７２、１２０ｈ细胞增殖促进。黄芪甲苷浓度为１０ｔｔｇ／ｍｌ，培养２４ｈ细胞增殖与ＤＭＳＯ组比较无差异，７２、１２０ｈ表现为增殖促进；黄芪甲苷浓度为５ｕｇ／ｍｌ，培养２４、７２ｈ细胞增殖与ＤＭＳＯ组比较无差异，１２０ｈ表现为增殖促

进。

２．非皱纹皮肤成纤维细胞：黄芪甲苷浓度为２０ｇｇ／ｍｌ，培养２４ｈ细胞增殖与ＤＭＳＯ组比较无差

异，７２、１２０ｈ表现为增殖促进。黄芪甲苷浓度为１０

ｕｇ／ｍｌ时，培养２４ｈ细胞增殖与ＤＭＳＯ组比较无

差异，７２、１２０ｈ表现增殖促进；黄芪甲苷浓度为５

ｕｇ／ｍｌ，培养２４ｈ细胞增殖与对照组比较无差异；

７２、１２０

ｈ表现为增殖促进。

３．老年成纤维细胞：该实验未发现黄芪甲苷对老年皮肤成纤维细胞的增殖有影响（Ｐ＞０．０５，表

１）。

根据上述结果，黄芪甲苷浓度为２０／，ｇ／ｍｌ时，

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对皱纹皮肤成纤维细胞的增殖有一定的抑制作用；黄芪甲苷浓度为５弘ｇ／ｍｌ时，对皱纹皮肤成纤维细胞的促增殖作用时间较迟；黄芪甲苷浓度为１０ｔｔｇ／ｍｌ时，对皱纹与非皱纹皮肤成纤维细胞促增殖作用时间一致，均为７２、１２０ｈ。故做免疫组织化学时，我们选用黄芪甲苷的浓度为１０ｔｕｇ／ｍｌ用于正式实验。

三、黄芪甲苷对３例皮肤成纤维细胞系胶原蛋白和弹性蛋白合成的影响

选用黄芪甲苷浓度１０”ｇ／ｍｌ，用免疫组织化学法分别检测３例皮肤成纤维细胞系胶原蛋白（Ｉ型、Ⅲ型）、弹性蛋白的合成（表２，图５～７）。

１．皱纹皮肤成纤维细胞：黄芪甲苷作用２４、７２、

１２０

异。黄芪甲苷作用２４ｈ后，细胞Ｉ型胶原蛋白表达与ＤＭＳＯ组比较无差异；作用７２、１２０ｈ后，细胞Ｉ型胶原蛋白表达增加。黄芪甲苷作用２４、７２、１２０

ｈ

后，细胞Ⅲ型胶原蛋白表达与ＤＭＳＯ组比较均无差异。

２．非皱纹皮肤成纤维细胞培养２４、７２、１２０

ｈ

后，黄芪组与ＤＭＳ０组比较，细胞弹性蛋白表达无差异。培养２４ｈ后，黄芪组细胞Ｉ型胶原蛋白表达与ＤＭＳＯ组比较无差异；培养７２、１２０ｈ后，细胞Ｉ型胶原蛋白表达增加。培养２４、７２、１２０ｈ后，细胞Ⅲ型胶原蛋白表达与ＤＭＳＯ组比较无差异。

３．老年皮肤成纤维细胞培养２４、７２、１２０ｈ后，黄芪组与ＤＭＳＯ组比较，细胞弹性蛋白表达无差

异。

ｈ后，细胞弹性蛋白表达与ＤＭＳＯ组比较无差

表１不同浓度黄芪甲苷对３例皮肤成纤维细胞系增殖的影响（Ａ。。。，孑±ｓ）

Ｔａｂ

１

Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅ

ａｔ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｓａｇｅｓ

ｏｎ

ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ

ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｒｅｅｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（Ａ５７０。。，ｚ－－＋－ｓ）

＊示与ＤＭＳＯ组比较Ｐ＜０．０５；＊＊示与ＤＭＳＯ组比较Ｐ＜ｏ．Ｏｌ

表２黄芪甲苷（１０／，ｇ／ｍ１）对３例皮肤成纤维细胞系蛋白合成的影响（Ａｓ，ｏ。。）

Ｔａｂ２

Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅ

ｏｎ

ｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔｈｒｅｅｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（Ａ５７。。）

＊示与ＤＭＳＯ组比较Ｐ＜０．０５；＊＊示与ＤＭＳＯ组比较Ｐ＜０．０１

主堡匡堂羞堂苤查盘查！！！！生！旦箜！！鲞笠；翅￡丛！』丛型垒笪！！坠垦塑里！！！』！！！！！！！！ｙ！！：！！！盟！：！

Ｉ型胶原蛋白阳性（ＳＡＢＣ染色，×ｉｏｏ）图２Ⅲ型胶原蛋白阳性（ＳＡＢＣ染色，×１００）图３波形蛋白阳性（ＳＡＢＣ

染色×１００）图４角蛋白表达阴性（ＳＡＢＣ染色，×１００）图５皱纹皮肤成纤维细胞培养１２０ｈ后Ｉ型胶原表达（ＳＡＢＣ染色，×１００）ａ．黄芪组ｂ．ＤＭＳＯ组图６无皱纹皮肤成纤维细胞培养１２０ｈ后Ｉ型胶原表达（ＳＡＢＣ染色，×１００）ａ．黄芪组ｂ．ＤＭＳＯ组图７老年皮肤成纤维细胞培养１２０ｈ后Ｉ型胶原的表达（ＳＡＢＣ染色，×１００）ａ．黄芪组ｂ．ＤＭＳＯ组图８皱纹皮肤成纤维细胞内的凋亡小体（箭头所示为凋亡小体，ＴＵＮＥＬ染色，×３００）

图１

Ｆｉｇ

１

ＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＦｉｇ

３

ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅＩ（ＳＡＢＣ，×１００）．

ｒｅａｃｔｉｏｎ

Ｆｉｇ

２Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ

Ｆｉｇ

４

Ｎｅｇａｔｉｖｅ

ｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｃｏｌｌａｇｅｎ

ｔｙｐｅⅢ（ＳＡＢＣ，×１００）．

ＳＡＢＣ，×ｌ００）．

Ｆｉｇ５

Ｐｏｓｔｉｖｅ

ｏｆｖｉｍｅｎｔｉｎ（ＳＡＢＣ，×１００）．Ｉ

ｉｎｓｋｉｎ

ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｉｔｈｗｒｉｎｋｌｅ

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ｒｅａｃｔｉｏｎ

ｏｆｋｅｒａｔｉｎ（

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅ

ａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅｆｏｒ１２０

ｈｏｕｒｓ（ＳＡＢＣ，×

１００）：ａ．Ｒａｄｉｘａｓｔｒａｇａｌｉｇｒｏｕｐ．ａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅｆｏｒｔｙｐｅＦｉｇ８

１２０ｓｋｉｎ

ｂ．ＤＭＳＯｇｒｏｕｐ．Ｆｉｇ６

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｙｐｅ

ＴｉｎｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｉｔｈｏｕｔｗｒｉｎｋｌｅＦｉｇ７

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆ

ｃｏｌｌａｇｅｎ、

ｈｏｕｒｓ（ＳＡＢＣ，×１００）：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ

ｉｎｓｋｉｎ

ａ．Ｒａｄｉｘａｓｔｒａｇａｌｉｇｒｏｕｐ．ｂ．ＤＭＳＯ

ｇｒｏｕｐ．ａｓｔｒａｇａｌｉ

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Ａｐｏｐｔｏｔｉｃｂｏｄｙ

ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｉｔｈｗｒｉｎｋｌｅ（ｓｈｏｗｅｄａｒｒｏｗｈｅａｄ，ＴＵＮＥＬ，×３００）．

培养２４、７２ｈ后，黄芪组细胞工型胶原蛋白表达与ＤＭＳＯ组比较无差异；培养１２０ｈ后，细胞工型胶原表达增加。培养２４、７２、１２０ｈ后，细胞Ⅲ型胶原蛋白表达与ＤＭＳＯ组比较无差异。黄芪甲苷浓度为

１０

胞系内均可见固缩深染的凋亡小体（图８）。流式细

胞仪检测细胞凋亡率，发现黄芪』苷浓度为１０

弘ｇ／ｍｌ时，培养１２０ｈ，皱纹皮肤成纤维细胞凋亡率由６９．２％下降到２６．３％（Ｐ＜ｏ．０１）；非皱纹皮肤成纤维细胞凋亡率由６７．３％下降到２８．８％（Ｐ％０．０１）；老年皮肤成纤维细胞凋亡率改变无统计学意义（Ｐ＞ｏ．０５）。

讨

论

ｔｕｇ／ｍｌ时，３例细胞系在培养１２０ｈ后，均出现增

殖促进、工型胶原蛋白合成增加，可以认为培养１２０ｈ后黄芪甲苷对细胞作用明显，故选用１２０ｈ作为检测细胞凋亡的时问点。

四、黄芪甲苷对３例皮肤成纤维细胞系凋亡的影响

细胞凋亡试剂盒原位染色，３例皮肤成纤维细

随着年龄增长，皮肤逐渐老化，皮肤衰老反映在

细胞水平即为细胞衰老。成纤维细胞是皮肤真皮中

史堡医堂羞堂苤查苤查！！！！生！旦筮！！鲞箜！塑￡坠！』Ｍ型垒！塾！坠Ｑ！！坐！！！』！！！！！！！！ｙ！！：！！！盟！：！

的主体细胞成分，它出现不可逆的生长抑制和选择性、特异性的基因表达及功能变化，是培养二倍体成纤维细胞衰老的重要特征［３］。大量研究证明，成纤维细胞是皱纹形成过程中最主要的效应细胞，其生物学特性改变包括：细胞问隙期阻滞Ｈ］，增殖能力降低；胶原蛋白合成降低［５３；表达的弹性蛋白变性、弹性纤维减少［６３；细胞凋亡率增加［４１；细胞表面ＴＧＦ一｜３受体减少［７３；合成抗氧化酶的能力下降凹１；线粒体ＤＮＡ突变ｐ３等。由于衰老皮肤成纤维细胞出现了一系列生物学特性改变，人们试图通过改善其生物学特性以延缓皮肤衰老和皱纹形成。

黄芪始载于《本经》，是古今常用的一种滋补上品。黄芪甲苷为我国有自主知识产权的一种黄芪皂甙类单体成分，是黄芪制剂中的主要有效成分。现代药理学研究证明，黄芪可延长人胎肺二倍体细胞

的自然衰老过程，使其衰老寿命从原来６１代延长至８８～９８代，１０ｐｔｇ／ｍｌ的黄芪甙可维持小鼠腹腔巨噬细胞生长达２０

ｄＬｌ…。有学者实验发现，黄芪甲苷可

抗皮肤表皮细胞衰老［１“。

本实验采用胶原酶消化培养法，选用第３～６代皮肤成纤维细胞，细胞生物活性已趋稳定，且可兼顾其遗传特性，细胞数量也达到实验所需口２Ｉ。黄芪皂甲苷最适浓度选择由１００／ｔｇ／ｍｌ（Ｏ．１％ＤＭＳＯ）倍比稀释至３．１２５ｐ．ｇ／ｍｌ（０．００３１２５％ＤＭＳＯ），统计结果显示，黄芪甲苷浓度为１２．５、６．２５、３．１２５／，ｇ／ｍｌ时，对细胞增殖的影响与ＤＭＳＯ组、细胞对照组比较均有促进作用；黄芪甲苷浓度为≥２５Ｆｇ／ｍｌ时，对细胞增殖的影响与ＤＭＳＯ组、细胞对照组比较均有毒性作用。黄芪甲苷浓度为＜３．１２５“ｇ／ｍｌ时，对细胞增殖的影响与ＤＭＳＯ组、细胞对

照组比较均无差异。预实验同时显示，ＤＭＳＯ组与细胞对照组比较无差异。故正式实验时选用黄芪甲苷浓度２０、１０、５／－ｇ／ｍｌ。本实验的结果显示，黄芪甲苷在较低浓度（５～２０Ｆｇ／ｍ１）时，可明显促进非皱纹和皱纹皮肤成纤维细胞的增殖，浓度在１０ｐｔｇ／ｍｌ时作用最明显。

皮肤胶原蛋白具有不同的类型，工、Ⅲ型主要分布在皮肤真皮层，以Ｉ型胶原蛋白为主，Ⅲ型胶原蛋白较少。年轻时胶原蛋白含量较丰富，当皮肤衰老时，胶原蛋白含量逐渐降低，是皮肤出现皱纹的主要

原因之一。本实验显示，黄芪甲苷浓度为１０ｔｔｇ／ｍｌ时，可促进皱纹、非皱纹和老年皮肤成纤维细胞工型胶原蛋白表达，其中１２０ｈ时作用最明显。提示一定浓度的黄芪甲苷可以促进皮肤胶原蛋白合成，延

缓皱纹的出现，改善皱纹程度。环境因素引起和促进细胞凋亡发生，可能是其诱发皮肤衰老的原因之一，该实验中黄芪甲苷浓度为１０／ｔｇ／ｍｌ，作用１２０

ｈ

后，皱纹和非皱纹皮肤成纤维细胞凋亡率均明显下降（Ｐ＜ｏ．０１）。由此可推测，黄芪甲苷可能通过降低人皮肤成纤维细胞的凋亡率，延缓皮肤衰老。

参

考文献

１

２

３

４

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