海南省卫生厅主要领导_用等位基因特异聚合酶链反应检测 葡萄糖

  本文关键词：海南省卫生厅科研基金，由笔耕文化传播整理发布。

用等位基因特异聚合酶链反应检测 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变

来源：青年人(Qnr.Cn) 更新时间：2010/3/16 19:28:27  【字体： 】

　葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是中国南方人群中一种常见的遗传病之一，与药物性溶血、感染性溶血及新生儿高胆红素血症等有密切的关系。引起G6PD缺乏症的主要原因是G6PD基因点突变［1］。现已发现引起中国人G6PD缺乏症的突变主要是1376G→T、1388G→A、95A→G、392G→T、592C→T及1024C→T等六种突变［2-5］。以往检测这些已知的突变，主要用错配扩增酶切法、等位基因寡核苷酸探针杂交等方法［2-5］。最近，杜传书等［6］报道用突变特异性扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)来检测中国人G6PD基因3种常见的突变。在此，我们介绍类似的检测已知G6PD基因突变的方法。

对象和方法

1　研究对象　经核苷酸顺序测定确定为1376G→T的男性样品3份，经错配扩增酶切法确定为95A→G的男性样品3份和392G→T的男性样品2份。正常对照样品10份。
2　引物顺序及扩增区域　扩增95A→G的引物：上游引物GdL1：5′-GGCGACGACGACGAAGCGCAG-3′;下游引物GdR2：5′-TTCCTGGCTTTTAAGATTGGG-3′;特异引物95G：5′-CTTCCATCAGTCGGATAGACG-3′。扩增392G→T的引物：上游引物GdL5: 5′-AAGAGAGGGGCTGACATCTG-3′;下游引物GdR5: 5′-CACGCTCATAGAGTGGTGGG-3′;特异引物392T：5′-AGAGGCGGTTGGCCTGTCACA-3′。 扩增1376G→T的引物：上游引物GdL11：5′-TGGTGGCAGGCAGTGGCATCAGCAA-3′;下游引物GdR13：5′-ATGGTCCCGGAGTCCTCCCGACTCG-3′;特异引物1376T：5′-GGGTGAAAATACGCCAGGCCACAA-3′。为了增加等位基因特异性引物的特异性，我们在3种特异引物的3′端的第4个碱基处增加一个错配碱基。扩增区域见图1。在检测每种突变的聚合酶链反应(PCR)中，均含有相应的上、下游引物及等位基因特异性引物。
3　PCR扩增的条件及结果观察　反应体积为25μl，含基因组DNA 0.5μg，2.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，30～50ng引物，1U Taq DNA聚合酶(PE公司或MBI公司)。扩增95G→A和392G→T的条件为：1×PCR缓冲液(PE公司)，PCR循环：94℃ 50s，60℃ 50s，72℃ 80s，共31个循环。扩增1376G→T的条件为：1×PCR缓冲液(MBI公司)，PCR循环：94℃ 50s，66℃ 50s，72℃ 80s，共31个循环。将扩增的PCR产物加在20g/L琼脂糖凝胶上电泳，用溴乙锭染色，在紫外灯下观察结果。

结果和讨论

　　突变特异性扩增系统(ARMS)也称为等位基因特异性聚合酶链反应(allele specific PCR)，是一种检测已知突变的方法［7］。其原理是根据PCR扩增时引物的延伸主要取决于引物3′端第1和第2位碱基是否与模板配对，3′端与模板不配对的引物不能延伸，根据已知的突变可以设计相应的引物。引物设计是此法检测突变的关键。有研究表明，不同的错配对阻止引物延伸的效果不同，如果在引物3′端的第2～4个碱基处增加一个错配碱基，则可增加引物延伸的特异性［7,8］；在检测G6PD基因的某些突变时，A/G错配更能有效地阻止引物延伸［6］。我们在设计引物时，392T和1376T两种引物采用A/G错配，95G引物采用G/T错配，并在此三种引物3′端的第4个碱基处增加了一个错配碱基。用等位基因特异PCR检测已知突变时，还应注意PCR的质控，如果PCR不出现扩增区带，原因除了是不存在所检测的突变外，还可能是DNA的质量问题。因此，用等位基因特异PCR检测突变时，最好选择一个PCR扩增片段作为内对照，以便判断PCR的质量。有些学者选择与突变位点无关、扩增效果稳定的片段作为内对照［6,9］。在我们的检测中，我们选择突变位点所在的外显子及外显子两侧的区域的扩增片段作为内对照，使扩增的内对照片段既作为PCR的质控，又可作为扩增突变位点的模板。在PCR产物中，正常样品只出现一条对照带，而有突变的样品，除了出现对照带外，还出现特异的扩增区带。我们曾用此法检测人β珠蛋白41-42缺失突变，有较好的效果［10］。图2为检测三种突变的PCR结果。在检测95G→A突变的PCR产物中，正常样品只出现一条812bp的扩增区带，有95G→A突变的样品出现812bp和94bp两条扩增区带；在检测392G→T突变的PCR产物中，正常样品只出现一条343bp的扩增区带，有392G→T突变的样品出现343bp和195bp两条扩增区带；在检测1376G→T突变的PCR产物中，正常样品只出现一条590bp的扩增区带，有1376G→T的样品出现590bp和261bp两条扩增区带。我们分析了10份正常样品及含有95G→A、392G→T及1376G→T突变的样品，未发现有假阳性和假阴性，表明我们设计的三种等位基因特异性引物具有高度特异性，能特异地检测上述三种突变。

图1　3个突变位点的扩增区域示意图

1～4号样品为392G→T的扩增结果:1,2为突变样品,3,4为正常对照;5～9号样品为95A→G的扩增结果:5,6为正常对照,7～9为突变样品;10为分子量标准:100bp ladder;11～15号样品为1376G→T的扩增结果:11,12为正常对照,13～15为突变样品;16为分子量标准:1kb ladder
图2　3个突变位点的PCR扩增结果

　　到目前为止，在中国人中至少已发现15种G6PD基因突变［1,11］，其中最常见的是1376G→T、1388G→A、95A→G、392G→T、592C→T及1024C→T等六种突变［2-5］，占G6PD基因突变的71%～95%，但仍有部分G6PD缺乏症的突变类型尚未被发现。以往检测这些已知突变主要用错配扩增酶切法、等位基因寡核苷酸探针杂交等方法。虽然这些方法能有效地筛查G6PD基因突变，但是费用较高、操作烦琐或需同位素。因此，建立更加简便、快速、经济的筛查方法仍有必要。等位基因特异PCR是一种较好的检测已知突变的方法，已应用于多种遗传病(如β-地中海贫血)的基因突变的检测［9,12］。最近，杜传书等［6］报道了检测中国人中三种常见G6PD基因突变(1388G→A，1376G→T，95A→G)的等位基因特异PCR方法，对于G6PD缺乏症的筛查，加快寻找新突变的速度具有重要的意义。与错配扩增酶切法、等位基因寡核苷酸探针杂交等方法比较，等位基因特异PCR更加简便、快速、经济。目前，已建立了检测中国人中4种常见的G6PD基因突变(1388G→A，1376G→T，392G→T，95A→G)的等位基因特异PCR方法，进一步完善其它常见G6PD基因突变的等位基因特异PCR的筛查方法，对于G6PD基因突变的筛查将具有重要的应用价值。

基金项目:海南省卫生厅科研基金资助项目（94－18）
作者单位：蔡望伟（570102　海口，海南医学院生化教研室）
周代锋（570102　海口，海南医学院生化教研室）
邝宇（570102　海口，海南医学院生化教研室）
蔡兰洁（570102　海口，海南医学院生化教研室）
周玉英（570102　海口，海南医学院生化教研室）

参 考 文 献

1，Vulliamy T,Luzzatto L,Hirono A,et al.Hematologically important mutations：glucose-6-phosphate dehydrogenase.Blood Cells Mol Dis,1997,23：302-313.
2，Chang JG，Chiou SS，Perng LI,et al.Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase（G6PD）deficiency by natural and amplification created restriction sites：five mutations account for most G6PD deficiency cases in Taiwan.Blood,1992,80：1079-1082.
3，杜传书，王菁，陈路明，等.中国人中所见的六种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的点突变.中华血液学杂志，1993，14：395-398.
4，唐东生，马燮琴，宋诚燕，等.干血纸片法用于广东人G6PD基因点突变筛查研究.中华血液学杂志，1998，，19：189-191.
5，谢建生，龙桂芳，唐志宁，等.广西地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变研究.中华医学遗传学杂志，1998，15：151-154.
6，Du CS,Ren XQ,Chen L,et al.Detection of the most common G6PD gene mutations in Chinese using amplification refractory mutation system.Hum Hered，1999，49：133-138.
7，Newton CR,Graham A,Heptinstall LE,et al.Analysis of any point mutation in DNA.The amplification refractory mutation system(ARMS).Nucl Acid Res,1989,17：2503-2516.
8，Kwok S,Kello DE,McKinney N,et al.The effect of primer-templete mismatch on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies.Nucl Acid Res,1990,181：999-1005.
9，杜传书，曾瑞萍，任晓琴，等.用ARMS法检测β地中海贫血C654-2T突变.中华血液学杂志，1998，19：544-545.
10，周代锋,韩建勋，蔡望伟，等.用等位基因特异PCR筛查海南汉族人β-珠蛋白基因41-42(-CTTT)缺失突变.中华医学遗传学杂志，1998，15：186.
11，Ren XQ,He YS,Du CS,et al.A novel missense mutation(G1381A) in the G6PD gene identified in a Chinese man.Hum Mut,1998,12：219.
12，毛跃华，孙琼，李争，等.应用多重等位基因特异PCR技术进行β-地中海贫血基因诊断.中华医学遗传学杂志，1995，12：209-211.

(收稿日期:1999-07-05)

    责任编辑：想飞 

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