蛋氨酸腺苷转移酶_谷氨酰胺合成的化学式_植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定71

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实验27植物体内GS谷氨酰胺合成酶活力的测定；【原理】；谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之；【仪器与用具】；冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪；提取缓冲液：；2+；0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，；反应混合液A（0.1mol/LTris-HCl缓；2+；内含80mmol/LMg，20mmol/L谷氨酸；反应混合液B

实验27 植物体内GS谷氨酰胺合成酶活力的测定

【原理】

谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1﹣1 protein·h。

【仪器与用具】

冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。 【试剂】

提取缓冲液：

2+

0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，内含2mmol/LMg，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl调至pH8.0，最后定容至250ml；

反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）：

2+

内含80mmol/L Mg，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；

反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：

反应混合液A的成分再加入80mol/L盐酸羟胺，pH7.4；

显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）： 3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml； 40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。 【方法】

1.粗酶液提取 称取植物材料1g于研钵中，加3ml提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g离心20min，上清液即为粗酶液。 2.反应 1.6ml反应混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6ml反应混合液A的为对照。

3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）。 4.原始数据记载 5.结果计算：

A

GS活力(A·mg﹣1 protein·h﹣1)＝P?V?t 式中 A—540nm处的吸光值；

P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）； V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）； T—反应时间（h）。

可溶性蛋白质含量的测定 ——考马斯亮蓝法 一、原理

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 二、材料、主要仪器和试剂 1、实验材料：植物叶片。 2、主要仪器

（1）分析天平、台式天平；（2）刻度吸管；（3）具塞试管、试管架；（4）研钵；（5）离心机、离心管；（6）烧杯、量筒；（7）微量取样器；（8）分光光度计。 3、试剂

（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液。

（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置1个月。 （3）乙醇；

（4）磷酸（85％）。 四、操作步骤

1、标准曲线制作

（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。

（2）0~1000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1000μg／mL的标准曲线。

2、样品提取液中蛋白质浓度的测定

（1）待测样品制备：称取样品2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4000r/min离心20min，弃去沉淀，，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。

（2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1号试管做空白。

五、结果计算

样品蛋白质含量（mg∕g鲜重）=(C×V/a)/W

式中：C为查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）； V为提取液总体积（ml）；

A为测定所取提取液体积（ml）； W为取样量（g）。

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