四翅滨藜抗逆相关基因的筛选及其通道蛋白功能解析

发布时间：2016-09-28 06:32

第一章    文献综述

在全球极端气候事件不断发生，世界人口数量正在不断急剧增长，人类活动范围扩大造成可耕作土壤面积降低，保证世界粮食安全的农业增长并未跟上粮食需求的增长背景下，粮食安全作为每个国家最重要的保障，成了一项非常重要的战略任务。逆境胁迫（包含生物逆境和非生物逆境）是目前农业生产中影响粮食产量最重要的限制性因素。在作物的整个生长发育季节中，会受到很多来自不同方面的不利环境因素的影响，使得植物生长缓慢，受到制约或者停止生长，最终导致作物品质下降，产量降低甚至绝产。其中，干旱、盐、营养元素不均衡（包括矿物质中毒和矿物质缺乏）和极端温度（高温，低温等）是影响全世界作物量的主要限制因素，每年直接由盐碱、干旱、低温等非生物逆境胁迫造成农作物的减产超过总产的20%。干旱和盐胁迫是这些严重影响作物生产的环境逆境因子中最主要的因素，是亟需研究和解决的科学和实际问题。在世界范围内，高于45%的农业耕地正遭受连年或者常年干旱威胁，而全世界38%的人口依赖这些土地生存，我国每年有7亿亩农田受旱灾威胁，干旱所造成的损失几乎是其它自然灾害所造成损失的总和。同时，我国有大量苏打盐碱地，盐渍化土壤漫延迅速，超过一半耕地受盐渍化侵蚀变成低产田，同时90%以上种植区的作物因水源和降雨不足进一步加剧了盐害程度，从而严重影响了作物的丰产和稳产，在当前人口多，耕地少的大环境下，，盐碱地改造以及通过基因工程改造作物耐盐性具有深远的意义。

......

第二章  四翅滨藜抗盐相关基因的筛选

2.1  材料

因为酵母质粒的拷贝数较低，直接用于 DNA 测序不能得到好的结果，故需要进行酵母质粒 DNA 营救。将（1）中提取出来的 DNA 电击转化（Gene Pulser Xcell Electroporation System, BioRad，USA ）到大肠杆菌 DH5α 中，然后用 PCR 进行验证加入片段（引物为 T7 和 pYES-R）。将 PCR 扩增出条带的大肠杆菌单克隆接种到 5 ml LB （100 mg/l 氨苄抗性）后 37 ，220 rpm过夜摇培，质粒提取用天根公司 TIANprep Mini Plasmid Kit （TIANGEN，China）完成。将提取的质粒 DNA 在深圳华大公司完成 DNA 测序，测序引物为 T7 和pYES-R （引物序列见附录二）。 

2.2  方法

将购买四翅滨藜种子用纱布保湿放在 28 培养箱中黑暗保存三到四天直至种子萌发，后将萌发的四翅滨藜种子移植到花土中，放到 21 到 23  恒温培养箱中，100 μmol photons.m-2.s-1，相对湿度为 60 %，14 h 光照/10 h黑暗处理，两个月后将四翅滨藜植物移植到相同光照和温度的 1/2 Hoagland 溶液中进行水培[86]。移植到上述水培条件下一周后，在 1/2 Hoagland 溶液中补充 400 mM NaCl 处理 48 h。植物嫩枝和根部在处理 48 h后收集起来，用液氮瞬间冰冻起来，保存在-80   备用。

第三章  四翅滨藜 AcNIP5;1基因抗逆功能解析 ...................... 44 

3.1  实验材料 ............. 44
3.2  实验方法 ............. 47
3.3  实验结果 ............................. 52
3.4  结论与讨论 ........................... 64 
第四章  四翅滨藜水通道蛋白 AcPIP2 抗逆功能解析 ................. 67 
4.1  实验材料 .......... 67 
4.2  实验方法 .......................... 67
4.3  结果 ....................... 70
4.4  结论与讨论 ..................... 85 
第五章  四翅滨藜重金属胁迫相关蛋白 AcHMA1 抗逆功能解析 ..................... 88 
5.1  实验材料与方法 ................. 88
5.2  实验结果 ................ 91
5.3  讨论与结论 ........... 99

第五章  四翅滨藜重金属胁迫相关蛋白 AcHMA1 抗逆功能解析 

5.1  实验材料与方法

很多重金属离子是生命代谢活动中的重要成分，但是当重金属含量超过一定值时往往出对生物体具有毒害作用。而金属耐受蛋白对这种毒害作用具有一定抗性。本研究从盐生植物四翅滨藜中分离和鉴定了一个重金属相关蛋白（heavy metal associated protein） AcHMA1。序列分析表明AcHMA1含有两个重金属结合结构域。对四翅滨藜进行重金属胁迫（Fe，Cu，Ni，Cd 或Pb），干旱（PEG6000） 和 碱（NaHCO3） 等胁迫处理能够高度诱导AcHMA1在四翅滨藜中表达但盐（NaCl）和低温胁迫使AcHMA1的表达量下降。随后，本研究利用酵母表达系统检测转AcHMA1酵母在重金属胁迫下的耐受性。在酵母中过表达AcHMA1 能够显著增加酵母细胞对过量铁胁迫耐受性， AcHMA1 同时也提高了酵母细胞对盐，碱，干旱和活性氧胁迫的耐受力。最后，亚细胞定位结果表明AcHMA1-eGFP融合表达蛋白定位在烟草细胞中的细胞膜上。因此，该研究结果表明AcHMA1 编码一个定位在细胞膜上的对重金属离子有一定抗性的重金属相关蛋白。同时，AcHMA1也可能参加植物对其他非生物胁迫的抗性。这部分内容整理发表在International Journal of Molecular Sciences上。 

5.2  实验结果

从四翅滨藜cDNA文库中通过EST测序获得一个全长为1270 bp的cDNA序列，命名为AcHMA1 （GenBank登录号：KF863910）。该cDNA编码一个包含316个氨基酸的开放阅读框，其中该编码蛋白富含赖氨酸（为总氨基酸含量的13.6%），该蛋白计算分子量为35.5 kDa，预计等电点pI为8.6。将AcHMA1放到NCBI BLASTP网站中进行序列分析搜索其来自不同植物的相似蛋白，结果表明AcHMA1和一个来源于葡萄（V. vinifera）的一个并未鉴定功能的蛋白同源性最高（图5.1）。
....

结  论

综合而言，本论文主要从构建盐胁迫下四翅滨藜cDNA文库进行EST测序和利用酵母筛选两种方法分离和筛选这种盐生植物中抗逆基因。通过酵母表达筛选得到53个抗盐蛋白，并对相关基因的抗盐特性利用qRT-PCR和酵母表达进行初步验证,此为第二章主要研究内容,相关数据已经整理完成投稿.在前期cDNA构建中筛选得到三个通道蛋白家族成员,其中AcNIP5;1和AcPIP2为水通道蛋白亚家族，而AcHMA1为离子通道蛋白家族成员。通常通道蛋白家族成员在植物抗逆过程中扮演重要角色，为了研究AcNIP5;1，AcPIP2和AcHMA1在植物抗逆方面具体功能，分别对AcNIP5;1，AcPIP2和AcHMA1进行了系统而详细的功能研究，通过酵母表达和在模式植物拟南芥中验证功能，干旱和重金属胁迫方面的初步功能。论文主要完成内容是对AcNIP5;1，AcPIP2和AcHMA1基因的鉴定和初步功能分析，但是对于相关调控网络和作用机理还需要深入研究，以完善人们对于植物中不同通道蛋白不同作用机理和生物学功能的认识，同时增强人们对盐生植物四翅滨藜抗盐机制决定基因及调控网络的了解与认识。

..........

参考文献（略）

本文编号：125065