桃褐腐病菌对多菌灵抗性的AS-PCR检测技术
发布时间：2021-10-24 20:37
由于杀菌剂的长期大量使用,植物病原菌对杀菌剂抗性问题日趋突出,严重影响病害防治的效果。褐腐病是一种在全世界范围内广泛发生和流行的重要果树病害。本文以桃褐腐病菌Monilinia fructicola为例,基于已知的多菌灵抗性机理,即靶标β微管蛋白基因TUB2的点突变E198A,建立了一种桃褐腐病菌对多菌灵抗性的等位基因专化性PCR检测技术。结果表明,碱基错配、内参引物、退火温度、dNTPs、Taq DNA聚合酶、专化性引物浓度及配比等因素均对检测效率有影响。经过对以上因素的优化,并对优化后的检测技术进行专化性及灵敏度评价,证实该检测技术能特异性地鉴别桃褐腐病菌M.fructicola对多菌灵抗性基因型E198A,且检测灵敏度可达到4.342 pg/μL病菌DNA,有望在实践中推广使用。
【文章来源】：植物保护. 2020,46(06)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
内参引物和特异性引物对多菌灵抗/感菌株的
反应体系中包含dNTPs、Taq DNA聚合酶等试剂,其质量及浓度是影响PCR反应的扩增效率以及避免产生非特异性扩增的重要因素。dNTPs的优化结果表明在设置的各个浓度梯度下反应均能发生,但特异性引物扩增的效率略有不同。0.2～0.3 mmol/L浓度扩增效率相对较高(图4a)。依据标准的PCR反应体系中推荐的dNTPs浓度为0.2 mmol/L,本着效率优先,节约为辅的原则,确定dNTPs的最佳浓度为0.2 mmol/L。Taq DNA聚合酶的优化,在不同的Taq DNA聚合酶浓度下反应均能发生,但特异性引物扩增的条带亮度随浓度增加大致呈依次递增的关系(图4b)。结果显示在Taq DNA聚合酶浓度为1.25 U下扩增的效率已较高,且接近推荐的浓度,故确定Taq DNA聚合酶的用量为1.25 U(25 μL体系)。图4 dNTPs (a)和Taq DNA 聚合酶(b)的优化
通过Nanodrop 2000测定抗性菌株YHC11-8c的DNA浓度为434.2 ng/μL,将DNA分别稀释为原浓度的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9,得到10个DNA浓度梯度,进行3次独立重复试验。结果发现该检测技术的灵敏度很高,最低可从稀释为10-5(4.342 pg/μL)的病原菌DNA中检测出抗性菌株,完全可用于生产实践(图7)。图6 AS-PCR检测方法的特异性
【参考文献】：
期刊论文
[1]果树褐腐病的研究现状及其展望[J]. 罗朝喜. 植物病理学报. 2017(02)
[2]一种基于LAMP技术快速检测小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性方法的建立及应用[J]. 段亚冰,效雪梅,杨莹,曹君红,施一渊,张晓柯,王勇,王建新,周明国. 南京农业大学学报. 2016(01)
[3]利用等位基因特异性PCR技术检测番茄高色素基因hp1和hp2的单核苷酸多态性[J]. 金凤媚,杨迎霞,薛俊,郏艳红,刘仲齐. 农业生物技术学报. 2009(05)
[4]单核苷酸多态性检测方法研究概述及其应用[J]. 李琳,杨德光,胡正,王永力. 玉米科学. 2009(03)
[5]美澳型核果褐腐病菌对甲基硫菌灵和啶酰菌胺的敏感性[J]. 樊锦艳,房雅丽,国立耘. 植物保护学报. 2009(03)
[6]等位基因特异PCR技术的研究与应用[J]. 陈吉宝,景蕊莲,员海燕,卫波. 植物遗传资源学报. 2005(04)
博士论文
[1]桃褐腐病菌和炭疽病菌对DMI杀菌剂的抗性研究[D]. 陈淑宁.华中农业大学 2017
[2]中国核果/仁果类果树褐腐病菌种群结构及Cyt b基因的遗传进化研究[D]. 尹良芬.华中农业大学 2015
本文编号：3455937
【文章来源】：植物保护. 2020,46(06)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
内参引物和特异性引物对多菌灵抗/感菌株的
反应体系中包含dNTPs、Taq DNA聚合酶等试剂,其质量及浓度是影响PCR反应的扩增效率以及避免产生非特异性扩增的重要因素。dNTPs的优化结果表明在设置的各个浓度梯度下反应均能发生,但特异性引物扩增的效率略有不同。0.2～0.3 mmol/L浓度扩增效率相对较高(图4a)。依据标准的PCR反应体系中推荐的dNTPs浓度为0.2 mmol/L,本着效率优先,节约为辅的原则,确定dNTPs的最佳浓度为0.2 mmol/L。Taq DNA聚合酶的优化,在不同的Taq DNA聚合酶浓度下反应均能发生,但特异性引物扩增的条带亮度随浓度增加大致呈依次递增的关系(图4b)。结果显示在Taq DNA聚合酶浓度为1.25 U下扩增的效率已较高,且接近推荐的浓度,故确定Taq DNA聚合酶的用量为1.25 U(25 μL体系)。图4 dNTPs (a)和Taq DNA 聚合酶(b)的优化
通过Nanodrop 2000测定抗性菌株YHC11-8c的DNA浓度为434.2 ng/μL,将DNA分别稀释为原浓度的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9,得到10个DNA浓度梯度,进行3次独立重复试验。结果发现该检测技术的灵敏度很高,最低可从稀释为10-5(4.342 pg/μL)的病原菌DNA中检测出抗性菌株,完全可用于生产实践(图7)。图6 AS-PCR检测方法的特异性
【参考文献】：
期刊论文
[1]果树褐腐病的研究现状及其展望[J]. 罗朝喜. 植物病理学报. 2017(02)
[2]一种基于LAMP技术快速检测小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性方法的建立及应用[J]. 段亚冰,效雪梅,杨莹,曹君红,施一渊,张晓柯,王勇,王建新,周明国. 南京农业大学学报. 2016(01)
[3]利用等位基因特异性PCR技术检测番茄高色素基因hp1和hp2的单核苷酸多态性[J]. 金凤媚,杨迎霞,薛俊,郏艳红,刘仲齐. 农业生物技术学报. 2009(05)
[4]单核苷酸多态性检测方法研究概述及其应用[J]. 李琳,杨德光,胡正,王永力. 玉米科学. 2009(03)
[5]美澳型核果褐腐病菌对甲基硫菌灵和啶酰菌胺的敏感性[J]. 樊锦艳,房雅丽,国立耘. 植物保护学报. 2009(03)
[6]等位基因特异PCR技术的研究与应用[J]. 陈吉宝,景蕊莲,员海燕,卫波. 植物遗传资源学报. 2005(04)
博士论文
[1]桃褐腐病菌和炭疽病菌对DMI杀菌剂的抗性研究[D]. 陈淑宁.华中农业大学 2017
[2]中国核果/仁果类果树褐腐病菌种群结构及Cyt b基因的遗传进化研究[D]. 尹良芬.华中农业大学 2015
本文编号：3455937
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/xszy/3455937.html
