寄生虫病实验室诊断的进展

发布时间：2017-01-01 16:20

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贺联印　杨铁生

寄生虫病实验室诊断的进展

贺联印　杨铁生

　　寄生虫病目前仍是危害我国人民身体健康的重要疾病。根据1992～1994年全国调查报告，共发现我国有人体寄生虫56种，主要为肠道寄生虫。其中半数以上为不常见虫种。尚不包括疟疾、黑热病、血吸虫、丝虫以及弓形虫、卡氏肺孢子虫、巴贝西虫和锥虫等重要寄生虫。人均寄生虫感染率高达62.6%。估计全国有7亿多人感染寄生虫，最多的1人同时感染9种寄生虫，特别在农村人口中。因此对寄生虫的检验工作仍是检验人员应该掌握的基本技术。但近年来，一些医院的检验人员逐渐忽略了对寄生虫的检验技术，常延误了诊断，影响给予患者应有的治疗，甚至造成严重的后果。这就要求检验人员能熟悉各种寄生虫的生活史及它们各个时期的形态特征。要求掌握对各种标本的处理技术(如取材、制片、染色、镜检)及必要的免疫学检验方法。
　　以下仅就近年来有关临床寄生虫学检验的发展情况作一些简单的介绍。　　
寄生虫病的寄生虫学检验
　　寄生虫病的寄生虫学检验仍以传统的方法为主。可以查阅有关书籍或资料。这里只简单介绍。
　　1.粪便检查，常规盐水涂片法常易漏诊一些原虫，特别是包囊。因此建议使用碘伊红染液，可使原虫易于检出。如要清楚的辨明内部结构则应做涂片，再以劳氏酸性红、固绿染色法或改良果氏三色染色法制片，以油浸镜镜检，才能准确诊断。如疑有隐孢子虫、微孢子虫、圆孢子虫则需做改良抗酸染色法确定诊断。为提高虫卵检出率，可选用加藤厚涂片法或醛醚沉淀法。涂片必须加盖片，以高倍或油浸镜头观察。
　　2.血液、体液或组织内原虫如疟原虫、利什曼原虫、锥虫、弓形虫、巴比西虫等，染色仍以瑞氏及姬氏染色法为主。以油浸镜头观察。微丝蚴染色除姬氏法外，还可用品蓝伊红快速染色法。效果较好。
　　3.卡氏肺孢子虫为一种机会性感染原虫(或真菌)，可在痰内或支气管灌洗液内查到。可用姬氏染色法或甲苯胺蓝(TBO)染色法，或环已烷四胺硝酸银(GMS)染色法检出。用油浸镜头观察。
寄生虫病的免疫学诊断
　　寄生虫病的诊断除了要掌握流行病学资料、询问病史以及体格检查以外，应尽可能寻找病原体。但在有些时候，检测病原体十分困难，需要采用免疫学诊断方法来检测抗原和抗体，或进行DNA检测。
　　一、应用于免疫学诊断的寄生虫抗原与抗体
　　应用于免疫学诊断的抗原有虫体抗原、排泄分泌抗原和膜抗原等。目前抗原的提取、分离、纯化越来越适合于免疫学诊断。虫体抗原是最常用的抗原，大致可分为整体抗原和可溶性抗原。整体抗原包括虫体、幼虫和虫卵。可溶性抗原包括粗抗原和部分纯化抗原，可作为皮试、血凝、ELISA、乳凝等的抗原。目前多采用纯化抗原，以提高试验的敏感性和特异性。
　　排泄分泌抗原又称代谢抗原。多收集自虫体的培养液，为功能性抗原，有较好的免疫原性，可以应用于免疫诊断。膜抗原分为膜表面蛋白和膜组成蛋白。前者可用金属螯合物或高离子强度的缓冲液溶解；后者可用清洁剂、有机溶剂和其它试剂如尿素、盐酸胍而获得。提取后可用于免疫诊断。此外，随着基因工程技术的发展，重组抗原越来越多的应用于免疫学诊断中。
　　应用于免疫学诊断的抗寄生虫抗体一般采用实验动物抗血清。近年单克隆抗体应用越来越广泛。
　　二、寄生虫病常用的免疫学诊断方法
　　目前，几乎所有免疫学方法均可用于寄生虫病的诊断，但并不是都很理想。现介绍几种常用的免疫学诊断方法。
　　1.环卵沉淀试验(COPT)：这是国内外公认的用以诊断血吸虫病的有效血清学方法之一。现在该法已趋向完善，不但提高了它的诊断效果，而且使该法更适合于现场推广应用。虫卵的处理有甲醛处理冰冻干卵抗原；热处理超声干卵抗原等。方法有双面胶纸条法、蜡封片法、塑料管、薄膜抗原片COPT，聚乙烯醇缩甲醛氯仿COPT(PVF-COPT)等，均有实用价值，已经作为基本消灭和消灭血吸虫病地区首先考虑应用的血清免疫学诊断方法。
　　2.间接红细胞凝集试验：已用于多种寄生虫病的诊断和流行病学调查。可分为间接血凝(IHA)，反向间接血凝(RIHA)，间接血凝抑制试验(IHAI)，反向间接血凝抑制试验(RIHAI)，可以检测抗原或抗体，有较高的敏感性和一定的特异性。单克隆抗体的应用使敏感性和特异性有所提高。
　　3.酶联免疫吸附试验(ELISA)：目前国外已将ELISA广泛应用于寄生虫病免疫学诊断中。许多商品试剂盒已被引入国内，只是价钱较贵，限制了它的应用。国内也研制了多种试剂盒，推广应用于各种寄生虫病诊断中。例如：血吸虫病、肺吸虫病、黑热病、包虫病、弓形虫病、隐孢子虫病、卡氏肺孢子虫病、囊虫病、阿米巴病等。除传统的ELISA外，又发展了K-ELISA、ABC-ELISA、DOT-ELISA、薄膜ELISA等，应用于血吸虫病、肺吸虫病、肝吸虫病等。可测抗体，也可测循环抗原及粪便样品、脓液及其它体液中的抗原。目前存在的问题主要有抗原制备和试验方法尚需进一步标准化和规范化。
　　4.间接荧光抗体试验(IFAT)：在国外已广泛应用IFAT作为寄生虫病的免疫学诊断方法。国内主要应用该法诊断疟疾、丝虫病、弓形虫病。在血吸虫病、肺吸虫病、华支睾吸虫病、包虫病、阿米巴病等也有应用。IFAT有较高的敏感性、特异性和重现性。但试验结果需用荧光显微镜观察反应，限制了该法的广泛应用。结果判定尚需有经验的人员，有一定的主观性。该法可检测血清中的抗体，也可检测组织内的寄生虫，如利什曼原虫、阿米巴、疟原虫、弓性虫等。
　　5.乳胶凝集试验(LAT)：LAT是以胶乳微粒作为载体的凝集反应。主要应用于弓形虫病、囊虫病、旋毛虫病、血吸虫病、棘球蚴病等诊断。该法有较好的敏感性和特异性，方法简便，判断结果快速，适于现场应用。国内外均有试剂盒供应，但国内应用不是很广泛。
　　6.免疫印迹技术(IBT)又称Western印迹试验：是以聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、固相酶免疫试验三种方法合一的实验技术，是近年来发展迅速的一种新技术。已应用于血吸虫病、绦虫病、包虫病、肺吸虫病、卡氏肺孢子虫、阿米巴病、囊虫病等。随着技术的完善，IBT可望成为高度敏感和特异的诊断寄生虫病和区别寄生虫感染期的有效方法。
　　7.免疫层析技术(ICT)：ICT是近年来发展起来的快速诊断技术，可检测抗体或抗原。应用于寄生虫病的有恶性疟原虫/间日疟原虫抗原检测和班氏丝虫抗原及利什曼原虫抗原检测。该法敏感、快速、特异性较好，，适于临床快速诊断和现场调查。目前商品试剂盒已引进国内(澳卡)。
　　8.PCR和核酸分子杂交技术：随着分子生物学的发展，PCR基因扩增技术及核酸分子杂交技术已越来越多的应用于寄生虫病的诊断和研究之中。如锥虫病、利什曼病、肺孢子虫病、贾第虫病、弓形虫病、血吸虫病、阿米巴病、包虫病、疟疾、丝虫病和肠球虫病等。这些技术虽具有高度的敏感性和特异性，但由于技术条件的要求很高，目前尚仅限于实验室试用阶段，尚无合格的商品试剂供应。
　　总之，由于免疫技术的发展及分子生物学、单克隆抗体的应用，已使寄生虫病免疫学诊断方法达到了简易、微量、快速、准确和经济的目的，显著地提高了诊断效果。相信随着高新技术的应用，将使寄生虫病免疫学诊断方法具有更为理想的诊断价值，以弥补病原学诊断的某些缺陷和不足。
　　三、常见寄生虫病的免疫学实验室
　　寄生虫病有许多种，有些为地区性，有些发病率不高。因此，下面简单介绍几种常见寄生虫病的实验室诊断方法。
　　1.阿米巴病：阿米巴病分肠道阿米巴病和肠外阿米巴病。肠道阿米巴病的诊断仍以粪便中发现阿米巴原虫为可靠依据。血清中抗体的测定有一定的参考价值，方法有IHA、IFAT、ELISA等。但抗体测定难以区分急性感染和治疗后保留的抗体。因病人痊愈后抗体高效价仍可持续数月至数年。有人采用纯化抗体--捕获夹心ELISA方法检测粪抗原；采用IFAT、ELISA法、对流免疫电泳等检测阿米巴肝脓肿患者的脓标本中的阿米巴滋养体，这些检测对于临床诊断、疗效考核、预后判断均具有重要意义。当然，阿米巴抗原的检测试验还有待于改进，以进一步提高敏感性和特异性。
　　2.疟疾：疟疾的确诊需要在血涂片或骨髓涂片中检查到疟原虫。但有时血中疟原虫数量较少，可能不易查到。因此近些年来，血清学诊断技术有不少发展。如：IFAT、IHA、ELISA等。但主要用于流行病学调查。在临床上常与血检法配合，对诊断、追索诊断、筛选供血对象、防止输血感染疟疾等也有一定帮助。(1)抗原检测，受染的红细胞、患者血清含有疟原虫及其裂解过程释放的可溶性抗原。近年来发展了许多抗原检测法，特别是恶性疟原虫。如凝胶扩散法、对流免疫电泳、IFAT、ELISA、DNA探针斑点杂交、抗原蛋白免疫印迹试验等。ICT既可测恶性疟抗原，又可测间日疟抗原。国内已应用此试剂盒检测临床标本。(2)抗体检测，疟疾患者感染过程中，可产生特异性IgG、IgM、IgA抗体。IgG抗体产生较晚，持续时间较长，对临床诊断意义不大；IgM抗体产生较早，但在疟疾复发及内脏受损的患者，均可再次增高，难以作为初发病的诊断指标。因此抗体检测一般用于血清流行病学调查，也可作为临床诊断的参考指标。方法有IFAT、LAT、IHA、ELISA、斑点酶法等。
　　3.弓形虫病：弓形虫病的诊断很大程度上要依靠血清学试验和寻找病原体。可从病人血液涂片、骨髓涂片、淋巴结穿刺、脑脊液沉渣涂片中通过染色、镜检查到弓形虫。抗体的检测方法有IHA、LAT、IFAT、ELISA、染色试验、胶体金技术、IBT等。循环抗原的检测方法有LAT、ELISA等。近年来应用PCR技术和DNA杂交技术检测弓形虫DNA，对诊断也有很大帮助。此外，采取肿大淋巴结、脑脊液和骨髓等进行动物接种分离病原体也是弓形虫病研究中常用的方法。
　　4.肺孢子虫病：临床上可以先采取由痰、支气管灌洗液及肺活检组织涂片染色法查找病原体。也可以应用对流免疫电泳检测抗原，但敏感性不高。用IFAT、ELISA、IBT检测抗体，对诊断有一定帮助。但因肺孢子虫肺炎多见于免疫缺陷者，其产生抗体的能力较低。此外，正常人群中也有一定的抗体水平。因此仅靠抗体效价难于作出诊断。近年来应用PCR技术对病人痰液、支气管肺泡液、血液标本中的肺孢子虫DNA进行检测，对临床诊断价值较高。
　　5.隐孢子虫病：一般由粪便中查找卵囊。由于免疫学的发展，单克隆抗体的应用，现在多采用IFAT、ELISA和IBT检测血清中隐孢子虫抗体。急性期病人血清抗体效价很高＞1∶40，而正常人一般＜1∶40。此外，使用单抗IFAT和单抗捕获法ELISA，检测粪便中卵囊和抗原，在临床实践中具有一定价值。
　　6.旋毛虫病：旋毛虫病的病原学诊断多依靠做肌肉活检压片或切片染色法做出。可用皮试过筛，也可用免疫学方法结合临床资料作出判断。常用的方法有IHA、LAT、IFAT、ELISA、间接过氧化物酶染色试验等来检测抗体。近年来用单克隆抗体-ELISA或斑点-ELISA检测血清中的循环抗原，具有一定的应用价值。
　　7.丝虫病：至1994年我国已在全国范围内基本消灭了丝虫病。后期鉴别因血内很难查到少数微丝蚴，因此血清抗体的检查是应用较多的方法。常用方法为IFA和ELISA。用马来丝虫成虫或微丝蚴抗原作间接荧光抗体试验；用马来丝虫可溶性抗原作ELISA检测患者血清抗丝虫抗体，敏感性较好。这两种方法已在国内丝虫病监测工作中推广应用。此外，有人采用马来丝虫成虫冰冻切片抗原作免疫酶染色试验，敏感性、特异性均较好；用马来丝虫微丝蚴和成虫排泌抗原作ELISA，诊断班氏微丝蚴血症者，阳性率也在95%左右。近来有用成虫可溶性抗原作斑点-ELISA诊断班氏和马来丝虫病微丝蚴血症效果也较好。
　　除检测抗体外，近来有用单克隆抗体双夹心ELISA或单克隆抗体斑点ELISA等方法检测丝虫循环抗原；用免疫层析技术(ICT)检测班氏丝虫抗原，敏感性及特异性均很好。既可用于诊断，又可用于考核疗效。后者已引用到国内使用。
　　8.血吸虫病：可先皮试过筛，阳性者再由粪便或肠黏膜活检组织中检查虫卵仍是常规方法。血吸虫病的免疫学诊断试验有许多种。检测血清抗体最常用的有环卵沉淀试验、IHA、ELISA及免疫印迹试验、乳胶凝集试验等。但由于患者血清中抗体在治愈后持续时间长，不能区别既往感染与现症病人，对药物疗效考核价值不大。近年来，人们致力于循环抗原的检测。方法有单克隆抗体--夹心ELISA、反向间接血凝、单克隆抗体--斑点ELISA等，用来检测急、慢性血吸虫病患者，结果比较满意。
　　9.肺吸虫病：肺吸虫病主要由卫氏和四川(斯氏)并殖吸虫引起。卫氏肺型还是由痰或粪便内检出虫卵确诊。卫氏肺外型或四川型常需用的免疫学检查方法有：(1)皮内试验：可用于过筛，有参考价值。(2)ELISA：检测血清中抗体，阳性率可达98%～100%。可用于诊断和现场调查。(3)斑点ELISA或单克隆抗体免疫印迹试验，均可用于检测血清循环抗原，可作为早期诊断及疗效考核的方法。此外，IFA、IHA、免疫印迹试验等也可用于检测抗体。
　　10.包虫病：包虫病的病原学诊断是由肝或其它部位包囊中抽取的液体沉淀内查找棘球蚴头节而作出。免疫学诊断应用较多的有：(1)包虫抗原皮内试验(casoni test)：敏感性较高，但特异性相对较差，不能区分活动性感染和非活动性感染，也不能用于考核疗效，阴性不能排除包虫病诊断。(2)ELISA：测定病人血清抗体，敏感性及特异性均较好。(3)循环抗原检测：应用斑点ELISA、单克隆抗体夹心ELISA等方法检测，能反映体内虫荷及存活情况，对抗体阴性者有一定的诊断价值。
　　11.囊虫病：囊虫病特别是脑囊虫病诊断较为困难。可用囊虫皮内试验过筛，再采用患者血清或脑脊液进行IHA、ELISA、IFA试验检测特异性抗体，或采用单克隆抗体ELISA检测血清和脑脊液中的循环抗原，对诊断和疗效考核均有一定帮助。必要时可进行皮下结节活检，可以确诊。

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