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嵌合分子VEGI~+
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本站编辑：admin 日期： 2010-08-12 18:38 点击：次
【中文摘要】:
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【中文摘要】一、目的1.应用分子生物学方法设计并合成新型血管生长抑制剂嵌合分子VEGI~+;构建较为理想的人恶性淋巴瘤裸鼠动物模型。2.以壳聚糖作为药物载体,将设计合成的VEGI、寡肽、VEGI~+嵌合合分子与其结合,构建出纳米复合体,并证明其具有良好的体外稳定性及有效的体内抑瘤作用,探讨纳米嵌合分子VEGI~+对人恶性淋巴瘤的抑制作用。二、方法1.设计特异性引物,通过PCR方法获得VEGI与寡肽CTTHWGFTLC相嵌合的融合基因VEGI~+,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,经酶切及测序鉴定后,与原核表达载体pET30a(+)重组,转化大肠杆菌BL21并诱导表达,His-Ni~(++)金属鏊合柱对表达产物纯化。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot对表达产物进行鉴定。2.以壳聚糖(CS)为药物载体,采用离子胶联-高压匀化工艺制备寡肽-CS纳米粒、VEGI-CS纳米粒、VEGI~+-CS纳米粒,用Micro-BCA法对所制得的纳米粒包封率、载药量进行测定,观察VEGI~+-CS纳米粒体外释放曲线,对其体外稳定性进行初步考察。3.应用人恶性淋巴瘤细胞CA-46株接种于6-8周龄的BALB/c裸鼠背部皮下,接种前每只裸鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg,1/日,共2次。两周后100%成瘤,成功构建裸鼠移植瘤模型。选用肿瘤大小相近的裸鼠35只,随机分为7组。在7组裸鼠的瘤体内分别多点注射嵌合分子VEGI~+、单纯VEGI、单纯寡肽、纳米VEGI~+、纳米VEGI、纳米寡肽及PBS,1/日,治疗28天。4.抗肿瘤疗效观察:每日观察裸鼠的生活状态,各组裸鼠开始治疗后分别于第0、7、14、21、28天用游标卡尺测量经过中心点的肿瘤的最长径(A)和经过中心点的肿瘤最短径(B),计算肿瘤体积(V)=A×B~2/2及计算肿瘤生长抑制率,公式为:抑瘤率=(对照组体积或瘤重-治疗组体积或瘤重)/对照组体积或瘤重×100%,至第28天时分别计算各组裸鼠死亡率。5.通过病理切片HE染色、免疫组化、瘤内微血管密度检测等主要手段分别来观察肿瘤组织的病理变化,初步了解VEGI~+-CS纳米粒的体外缓释特性及对肿瘤新生血管的抑制情况。三、结果1.酶切鉴定及测序结果表明,构建的融合基因VEGI~+与预期结果相符。构建好的表达质粒pET30a-VEGI~+转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳显示其表达形式以包涵体为主。经过复性和纯化,SDS-PAGE电泳及Western-blot结果表明,嵌合蛋白VEGI~+的分子量为23KD左右,纯度约90%。2.本实验所制得的VEGI~+-壳聚糖纳米粒,外观形态较为圆整,呈单分散均匀分布,粒度分布较窄,平均粒径在100nm左右。测得三种药物的包封率、载药量分别为:寡肽-CS纳米粒:包封率(79.4%),载药量(0.66%);VEGI-CS纳米粒:包封率(83.4%);载药量(10.4%);VEGI~+-CS纳米粒:包封率(81.9%),载药量(0.66%),具有良好的体外稳定性。3.建立裸鼠人恶性淋巴瘤动物模型,裸鼠在实验期间生存状态良好,无死亡;七组肿瘤体积随着时间不断增长,但VEGI~+-CS-NPs组、VEGI~+组的生长速率明显减慢,自治疗第7天测量,肿瘤体积就明显小于PBS组,组间体积差异非常显著(P＜0.01=;VEGI-CS-NPs组、纳米寡肽组、VEGI组、寡肽组与PBS组相比肿瘤生长也受到抑制,组间体积差异显著(P＜0.05,其中纳米剂型组比单纯药物组间差异亦有差异。治疗28天后,以PBS组作为对照组,VEGI~+-CS-NPs组比VEGI~+组、VEGI-CS-NPs组、VEGI组、纳米寡肽组、寡肽组具有更高的肿瘤生长抑制率;而单纯寡肽组又比单纯VEGI组的效果好。4.常规HE染色结果显示VEGI~+-CS-NPs组可见瘤组织变性坏死后的大量结缔组织增生,纤维化明显。免疫组化VEGF/CD34染色显示VEGI~+-CS-NPs组只有很少的VEGF的表达,微血管密度值为18.3±4.5,与其它各组差异均显著(P＜0.05)。四、结论1.成功构建了重组表达载体pET30a-VEGI~+,并在大肠杆菌中诱导表达,亲和层析纯化后获得纯度较高的嵌合蛋白VEGI~+。2.纳米嵌合分子VEGI~+较嵌合分子VEGI~+具有缓释作用,体外稳定性好,对淋巴瘤抑制效果明显。3.纳米嵌合分子VEGI~+对恶性淋巴瘤具有明显的抑制作用,可以作为一种有效的靶向于恶性淋巴瘤血管的治疗药物,具有良好的发展前景。
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