诺卡菌抗酸染色方法的改进和基于rpoB基因的诺卡菌PCR-RFLP分型研究

发布时间：2021-04-20 16:29

  目的： 本研究改进了诺卡菌的抗酸染色方法，并以rpoB作为靶基因，用诺卡菌标准菌种进行PCR-RFLP分型鉴定研究，旨在建立诺卡菌快速鉴定PCR-RFLP操作方案和RFLP标准指纹图谱，为临床快速、准确鉴别诊断提供可靠的参考标准。 材料和方法： 1.采用革兰染色方法和抗酸染色方法对标准菌进行染色，同时设计7个浓度梯度的脱色液，进行改良抗酸染色，综合比较三种染色方法的结果。 2.分别对7种23株诺卡菌国际参考株的rpoB基因的360bp特异片段进行PCR扩增，PCR产物进行测序和限制性片段长度多态性（RFLP）分析。 结果： 1.在显微镜下观察诺卡菌有三种形态，分别为杆状、丝状和球状。用0.125%的硫酸和0.063%的硫酸作为脱色液的改良抗酸染色方法染色阳性率最高，为100%；用4%硫酸脱色的改良抗酸染色方法染色阳性率最低，为30.43%。所用硫酸脱色液浓度为4%、2%、1%、0.5%的改良抗酸染色法进行染色时，阳性对照结果始终为阳性，阴性对照结果均为阴性；使用硫酸脱色液浓度为0.25%、0.125%、0.063%的改良抗酸染色时，阴性对照染色结果为假阳性。2.应用单一限制性内切酶HaeIII对rpoB基因360bp的纯化PCR产物进行酶切，得到7种图谱，将7种诺卡菌分成7类，应用单一限制性内切酶MspI对rpoB基因360bp的纯化产物进行酶切得到16种图谱，将7种诺卡菌分成16类。HaeIII和MspI两种限制性内切酶联合应用共得到16种图谱，其中新星诺卡菌和豚鼠诺卡菌具有种特异性图谱，，星形诺卡菌有3种图谱，巴西诺卡菌有4种图谱，鼻疽诺卡菌有3种图谱，肉色诺卡菌有2种图谱，南非诺卡菌有2种图谱。 结论： 1.在阳性对照和阴性对照都获得准确结果的基础上，0.5%硫酸脱色液改良抗酸染色方法为最佳染色方法，对诺卡菌的检出率最高，为91.3%。 2.本研究建立的PCR-RFLP方法共得到16种图谱，能明确鉴定7种23株诺卡菌，为临床诺卡菌的鉴定和防治研究提供了良好的基础。 3．对中国四省临床分离37株诺卡菌的鉴定，36株属于鼻疽诺卡菌，1株属于小球诺卡菌。



本文编号：1448118