Twist在细胞多药耐药中的作用及可能的机制研究
发布时间：2018-07-04 08:38
本文选题：HEK-293 + Twist ； 参考：《泸州医学院》2012年硕士论文
【摘要】：目的：采用细胞划痕、CCk-8、RT-PCR、Western Blot等技术对照观察Twist稳定转染的人肾上皮细胞株HEK-293-Twist和空载体转染的HEK-293-vector细胞株的迁移能力、对肿瘤化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)、曲古菌素A(TSA)、紫杉醇(Taxol)的敏感性以及Twist、 NF-κB、Akt、FHIT基因表达的差异性,初步探讨Twist在肿瘤细胞多药耐药中的作用及可能存在的分子作用机制。方法：(1)细胞划痕实验：取对数期HEK-293-Twist和HEK-293-vector细胞,经胰酶消化后计数,用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬,调整细胞密度为5×105/ml,接种单细胞悬液于六孔板中,待细胞密度达80%时,换正常培养基为无血清的基础培养基,待细胞贴壁率达90%以上时,用无菌枪头在每个孔中长满的单层细胞上迅速而轻轻地划1-2道痕,间距0.5～1cm,1×PBS冲洗掉脱落的细胞,继续在37℃5%CO2培养箱培养,分别在0、7、24h时间点拍照观察,比较不同细胞划痕修复速度。(2)Cell Counting Kit-8:调整对数期HEK-293-Twist和HEK-293-vector细胞密度为1×104/ml,按每孔100μl接种于96孔板,待细胞贴壁后每种细胞分为不同浓度TSA组(1、4、8μmol/L).5-Fu组(2.5、12.5、62.5、312.5μol/L)、Taxol组(0.276、1.38、6.9、34.5μmol/L)、对照组(不加药物)和空白组(只加培养基不加细胞),每组6复孔,培养24h后每孔加入10μl CCK-8,继续孵育3h。在酶联免疫检测仪上以450nm为检测波长,630nm为参考波长测量各孔的吸光度值(A)。(3)逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR)方法：采用Trizol法,按照总RNA提取试剂盒说明提取HEK-293-Twist、HEK-293-vector,总RNA,逆转录成cDNA后,PCR扩增Twist、FHIT基因,凝胶成像系统采集图像,相应软件分析结果,探讨细胞中Twist与FHIT表达的相关性(4) Western Blot法检测Twist、NF-κB、Akt、FHIT蛋白的表达：用RIPA裂解液提取HEK-293-Twist、HEK-293-vector细胞和加药处理后的细胞总蛋白,考马斯亮蓝G-250测定蛋白浓度后按每孔40μg上样量进行SDS-PAGE电泳分离,转膜后加入5%脱脂奶粉封闭1h,弃封闭液分别加入Twist、NF-κB、Akt、FHIT一抗作用2h,再与HRP标记的二抗室温振摇孵育1h,于暗室中曝光显影,凝胶成像分析系统对胶片进行灰度扫描并运用Quantity one软件对得到的图像进行条带灰度分析,计算目的蛋白与内参灰度比值。结果：(1)细胞划痕现象：随着培养时间的延长,两种细胞株均出现明显向划痕处的迁移,但速度不同,7h时,两种细胞株的迁移比较无明显差异,24h时,HEK-293-Twist细胞株划痕已近弥合,而HEK-293-vector细胞株与7h时相比,划痕变化不明显。(2)不同化疗药处理后,CCK-8检测结果显示,TSA、5-Fu、Taxol对HEK-293-Twist、HEK-293-vector两种细胞生长均有抑制作用,其中低浓度的TSA和5-Fu对两种细胞的抑制作用不明显,随着浓度的增高出现一定程度的增效作用,Taxol则在低浓度便出现明显的抑制作用,并且HEK-293-Twist细胞株对三种化疗药物的敏感性明显弱于HEK-293-vector细胞株(p0.05)。(3)RT-PCR结果显示：Twist在HEK-293-vector细胞株中仅有微弱表达,在HEK-293-Twist中表达明显(p0.05)；FHIT在HEK-293-Twist和HEK-293-vector细胞株中均有基础性表达,但在前者的表达量明显低于后者(p0.05)。(4)从WB结果可见：在HEK-293-Twist细胞株中Twist高表达,NF-κB、Akt的表达也明显强于HEK-293-vector细胞株中的表达,而FHIT的表达弱于HEK-293-vector细胞中的表达,在HEK-293-vector中Twist无表达；在TSA、Taxol和5-Fu处理组HEK-293-Twist细胞株中Twist、NF-kB. Akt的表达均明显高于HEK-293-vector细胞中的表达,FHIT的表达也明显高于HEK-293-Vector细胞中的表达,随着药物作用浓度的增高,Twist与Akt、NF-kB表达的变化趋势相同(p0.05),而FHIT则与Twist表达的变化趋势相反(p0.05)。结论：1.在HEK-293细胞中,Twist可以促进细胞的迁移,提高细胞对化疗药物TSA、5-Fu、Taxol的抵抗性。2. HEK-293-Twist细胞中Twist的表达可能与NF-κB、Akt的表达存在正相调节,与FHIT的表达存在负相调节,提示NF-κB、Akt、 FHIT与Twist的表达存在一定的相关性,这可能参与了Twist促进细胞多药耐药形成的作用机制。
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本文编号：2095483
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