肠道病毒71型基因分析、病毒拯救、毒力及免疫原性的比较研究

发布时间：2021-03-24 12:29

　　近年来，手足口病（hand, foot and mouth disease, HFMD）在我国呈高发态势，肠道病毒71型（enterovirus71, EV71）是其主要病原体之一，尤其重症HFMD患者大多由EV71感染所致[1]。深入研究EV71的毒力和致病机理，对于HFMD的防治有着极其重要意义[2，3]。我们从HFMD重症患者咽拭子标本中分离EV71毒株，通过基因序列分析、病毒拯救等研究，分析比较分离病毒的毒力和免疫原性，为今后EV71动物模型的构建、EV71致病机理和疫苗的研究打下了基础。本研究从2名临床确诊HFMD并出现严重神经系统症状患儿的咽拭子标本中分离到2株病毒，经核酸分析和美国ATCC肠道病毒标准血清中和实验，确定为EV71。通过空斑实验，克隆得到两株EV71病毒，分别命名为EV71-961和EV71-102。经肠道病毒VP1区通用引物扩增后，序列分析初步确定两株分离病毒均为EV71C4亚型。病毒全基因序列分析显示：两株病毒基因组全长（不含polyA尾）均为7407nt；EV71-961全基因序列与Chongqing3-09-China（Genbank Number:... 

【文章来源】：中国人民解放军医学院北京市

【文章页数】：104 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

EV71病毒基因组示意图

、实验材料、 细胞和 EV71 标本.1 细胞：Vero 细胞由本室保存。.2 EV71 标本：2008 年湖南一名 3 岁和 2009 年湖南一名 1 岁均出现严重的手足口病患儿咽拭子标本。、 载体、引物及感受态菌.1 载体.1.1 平端克隆载体：克隆载体质粒pEASYTM-Blunt Zero Vector（图1.2），载体,专为连接PCR高保真Taq酶（pfu酶）扩增的产物片段而设计。该载杀基因表达与否筛选阳性重组子。当载体与目的片段连接成功，载体自带无法正确表达，包含重组子的细胞可以正常生长；当载体与目的片段连杀基因可以正确表达，包含载体的细胞则无法生长，即“Zero”背景。该长片段克隆，且含氨苄青霉素、卡那霉素两种筛选标记。

图1.3 克隆载体 pEASY-T3 图谱2.2 引物合成：参照分离株VP1测序结果，经Genbank序列比对确定为EV71 C4亚型，依据Genbank中C4序列保守区，使用Lasergene软件设计4条全基因扩增引物、4条EV71特异性鉴定引物、2条EV71 VP1区通用引物、1条逆转录引物（表1.1）。引物由Invitrogen公司合成。引物1F 5’端引入限制性酶切位点和T7RNA聚合酶启动子序列，1R的5’端引入限制性酶切位点，2R 5’端引入限制性酶切位点和26个碱基T（表1.1）。表1.1 病毒分离株全基因扩增引物扩增片段名称及位置 名称 序列 酶切位点A段1-3778 1F5’-AGGCGGATCGAT TAATACGACTCACTATAGTAAAACACCCTGTGGGTTGCACC-3’ClaⅠ1R 5’-GCGGCCGCACCACAAGAGGTCCCTGACGTCT-3’ NotⅠB段 3342-7424 2F 5’-AGTCTGGGGCCATTTATGTGGGCAACTTTA-3’2R5’-GCGGCCGC TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTGCTATTCTGGTTATAAC-3’NotⅠ逆转录引物 oligdT26 5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’鉴定引物732-1474 JD1F 5’-CAGCTAAACATGGGTTCG-3’JD1R 5’-ATACCAGCATCAAGCACG-3’鉴定引物5008-5735 JD2F 5’-GGGAATACAGCAATAGGTCCG-3’JD2R 5’-TGATGGCATGTGCTCTGTG-3’通用引物2367-2386 VP1-F3 5’-GCAGCCCAAAAGAATTTCAC-3’通用引物3346-3365 VP1-R3 5’-CACATAAATRGCCCCAGACT-3’注：序列下划线为 T7RNA 聚合酶启动子序列，斜体为酶切位点序?

【参考文献】：
期刊论文
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[2]阳离子脂质体转染效率影响因素的研究进展[J]. 黄柯鑫,赵斌.  医学理论与实践. 2012(14)
[3]北京市2010年手足口病死亡危险因素分析[J]. 李锡太,刘白薇,贾蕾,黎新宇,曲梅,李洁,李爽,吴晓娜,高志勇,黄芳,王全意.  中华疾病控制杂志. 2012(05)
[4]不同EV71毒株的免疫保护差异性研究[J]. 汪颖,叶祥忠,李娟,贾继宗,韩金乐,李艳,李益民,游松.  中华微生物学和免疫学杂志. 2010 (10)
[5]2008年中国手足口病流行特征分析[J]. 王琦,王子军.  疾病监测. 2010(03)
[6]肠道病毒71型的研究进展[J]. 周世力,杨帆,金奇.  病毒学报. 2003(03)
[7]手足口病流行特点及其防治[J]. 何家鑫,沈晓娜.  海峡预防医学杂志. 2001(03)
[8]三种不同转染方法拯救病毒的比较研究[J]. 侯俊,罗生栋,胡燕,沈宏辉,白冰珂,柴燕涛,王志杰,貌盼勇.  中华实验和临床病毒学杂志. 2013 (06)



本文编号：3097725