KLF9在机体糖异生中的作用及PGC1α诱导Cidec表达的研究

发布时间：2023-06-02 23:30

　　第一部分 KLF9对PGC1a表达的调控以及在糖异生中的作用 肝脏糖异生对于长时间饥饿情况下生物体的生存十分必要,但是在糖尿病情况下被非正常开启。已知转录共激活因子过氧化物酶体增殖受体Y共激活因子1(PGC1a)在此过程中发挥重要的生理功能。PGC1a是糖异生酶基因的上游调控因子,对于这些酶表达的激活发挥重要的调控功能。PGC1a被cAMP通路和转录因子CREB的激活所调控。KLF9是Kruppel-like factors锌指蛋白家族的成员,又称为基础转录序列结合蛋白1(BTEB1),是结合高GC结构序列的转录因子。KLF9能够调节孕酮受体(PR)的表达,其缺失会降低子宫PR目标基因对于孕酮的敏感性,导致生育能力低下。在肝脏中,KLF9结合促进HNF4a,调节甲状腺激素在肝脏中的作用。KLF9能够结合PPARγ启动子,调控脂肪组织的发育。通过体内和体外实验,我们证明了KLF9能够结合到PGC1a启动子并调节的PGC1a的表达,进而,对肝脏糖异生酶的表达量进行调控。在糖尿病模型小鼠上,降低KLF9的表达量,能够有效提高机体对胰岛素的敏感性,并且对糖尿病造成的高血糖具有改善效果。本实验首...

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
第一部分 KLF9对PGC1A表达的调控以及在糖异生中的作用
    摘要
    ABSTRACT
    前言
    材料和方法
        1 实验材料
            1.1 动物
            1.2 菌株
            1.3 质粒载体
            1.4 细胞株
            1.5 实验用工具酶以及DNA,蛋白marker
            1.6 试剂盒
            1.7 主要化学试剂(按试剂公司分类)
            1.8 主要仪器及设备
            1.9 分析软件
            1.10 实验所用引物
        2 实验方法
            2.1 质粒载体的构建
                2.1.1 PCR法扩增目的片段
                2.1.2 PCR点突变KLF-9在PGC1α启动子上的结合位点
                2.1.3 DNA琼脂糖凝胶电泳
                2.1.4 DNA及载体的酶切
                2.1.5 片段与载体的连接
                2.1.6 连接产物的转化
                2.1.7 阳性克隆的筛选
                2.1.8 质粒DNA的大量制备
            2.2 细胞培养实验
                2.2.1 细胞的培养条件
                2.2.2 细胞的复苏,传代培养与冻存
                2.2.3 细胞计数与存活测试
                2.2.4 肝原代细胞的分离以及培养
                2.2.5 3T3-L1细胞的培养及诱导分化
                2.2.6 转染实验
            2.3 重组腺病毒的构建与包装
            2.4 腺病毒感染细胞
            2.5 染色体免疫共沉淀实验
            2.6 DNA、RNA提取及cDNA的合成
                2.6.1 总RNA的提取
                2.6.2 总DNA和蛋白质的分离提取
                2.6.3 总RNA逆转录合成cDNA
            2.7 WESTERN BLOT
                2.7.1 SDS-PAGE电泳
                2.7.2 SDS-PAGE电泳步骤
                2.7.3 转膜
                2.7.4 Western印迹杂交
            2.8. Real-Time PCR实验
            2.9 dual luciferase reporter assay system实验
            2.10 小鼠血糖测定
            2.11 GTT,ITT实验
        3 实验流程
    实验结果
        1. KLF9和PGC1A基因表达被饥饿诱导
        2. KLF9调控PGC1A转录是通过结合在PGC1A启动子上实现
        3. KLF9和PGC1A在体内的相互作用
        4. 干扰KLF9表达对糖异生调控基因表达的影响
        5. 干扰KLF9表达降低肝原代细胞的葡萄糖输出
    讨论
    小结
第二部分 PGC1A与PPARF共激活CIDEC的表达
    摘要
    ABSTRACT
    前言
    材料与方法见第一部分
    实验结果
        1. PPARΓ与PGC1A直接结合于CIDEC的启动子而调控转录
        2. PPARΓ特异激动剂PIOGLITAZONE可促进CIDEC MRNA的转录
        3. CIDEC过表达的3T3-L1细胞中对脂肪合成以及能量代谢相关基因的影响
        4. 在肝脏细胞中过表达CIDEC基因明显增加细胞质脂滴的体积
    讨论
    小结
参考文献
附录
综述
    参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3828230