海洋微藻源DHA抗原抗体的制备及金标检测卡的研究

发布时间：2024-03-08 03:53

　　二十二碳六烯酸(DHA)是维持人体正常生长发育的重要成分。DHA作为人体必需不饱和脂肪酸,不能在人体内直接合成,只能从饮食中摄取。随着微藻源DHA在食品添加中的普遍应用,微藻源DHA的质量安全也逐渐受到消费者的关注。虽然有关DHA的研究报道和商业产品层出不穷,但目前市场上尚未生产出检测微藻源DHA含量的金标快速检测产品。为此,本课题在参考前人研究半抗原偶联技术、抗体制备技术等基础上,研究制备微藻源DHA偶联抗原和抗体。并对DHA抗原抗体在胶体金免疫层析技术上的应用进行初步探讨。本实验通过碳化二亚胺活性酯法和混合酸酐法,合成免疫抗原DHA-BSA和包被抗原DHA-OVA。通过蛋白电泳、红外光谱扫描、紫外光谱扫描分析,半抗原DHA与载体蛋白BSA、OVA偶联成功,且免疫抗原的偶联比为4:1和17:1,在适宜的偶联比范围内。用免疫抗原对Balb/c小鼠进行四次免疫,并取血清进行效价检测。最终选用20μg/ml的包被抗原进行包被,5%脱脂奶粉进行封闭,测得多抗血清效价为128000。通过阻断ELISA测定,DHA抗体的敏感性IC50为40.44μg/ml。用蛋白纯化柱Protein G对抗体进...

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 课题研究背景
    1.2 DHA概述
        1.2.1 DHA简介
        1.2.2 DHA的来源
        1.2.3 DHA的生理功能
        1.2.4 DHA的应用及添加量
        1.2.5 常用检测方法
            1.2.5.1 气相色谱法(GC)
            1.2.5.2 气相色谱-质谱联用法(GC-MS)
            1.2.5.3 高效液相色谱法(HPLC)
    1.3 人工抗原合成方法及其原理
        1.3.1 人工抗原简介
        1.3.2 载体的选择
        1.3.3 偶联方法的选择
    1.4 胶体金免疫层析技术概述
        1.4.1 胶体金及其制备
        1.4.2 胶体金免疫层析技术及其原理
        1.4.3 胶体金免疫层析技术分类
            1.4.3.1 间接法制备胶体金免疫层析试纸条
            1.4.3.2 竞争法制备胶体金免疫层析试纸条
            1.4.3.3 夹心法制备胶体金免疫层析试纸条
        1.4.4 胶体金免疫层析技术在食品安全检测中的应用
            1.4.4.1 农药兽药残留检测
            1.4.4.2 病原微生物的检测
            1.4.4.3 食品中其他小分子物质的检测
        1.4.5 胶体金免疫层析技术的发展趋势
    1.5 本课题研究目的及意义、研究内容和创新之处
        1.5.1 本课题研究目的及意义
        1.5.2 本课题主要研究内容
        1.5.3 本课题创新之处
        1.5.4 课题研究的技术路线
第二章 材料与方法
    2.1 实验仪器设备
    2.2 实验材料及试剂
        2.2.1 实验动物
        2.2.2 实验试剂耗材
        2.2.3 实验耗材
        2.2.4 实验所需试剂的配制
            2.2.4.1 DHA人工抗原制备及鉴定所需溶液的配制
            2.2.4.2 抗体纯化鉴定所需溶液的配制
            2.2.4.3 金标检测卡所需溶液的配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 DHA人工抗原的制备及其鉴定
            2.3.1.1 免疫抗原(DHA-BSA)的制备
            2.3.1.2 包被抗原(DHA-OVA)的制备
            2.3.1.3 DHA人工抗原的鉴定
        2.3.2 DHA抗体的制备
            2.3.2.1 小鼠免疫
            2.3.2.2 血清效价检测
            2.3.2.3 细胞融合
            2.3.2.4 杂交瘤细胞筛选
        2.3.3 DHA抗体的纯化与鉴定
            2.3.3.1 抗体纯化
            2.3.3.2 抗体浓度测定
            2.3.3.3 SDS-PAGE蛋白电泳检测
        2.3.4 胶体金的制备及其表征研究
            2.3.4.1 胶体金的制备
            2.3.4.2 胶体金制备影响因素的测定
            2.3.4.3 胶体金鉴定
        2.3.5 DHA金标检测卡的初步探究
            2.3.5.1 金标记抗体的制备
            2.3.5.2 金标记抗体的稳定性
            2.3.5.3 金标记抗体效果的鉴定
            2.3.5.4 金标检测卡的组装及性能测试
第三章 结果与讨论
    3.1 免疫抗原的鉴定与分析
        3.1.1 蛋白电泳鉴定
        3.1.2 红外扫描鉴定
        3.1.3 紫外全波长扫描
        3.1.4 免疫抗原偶联比测定
    3.2 抗体的制备与鉴定
        3.2.1 多克隆抗体效价检测
            3.2.1.1 包被浓度的确定
            3.2.1.2 封闭液的选择
            3.2.1.3 抗血清效价的检测
            3.2.1.4 竞争抑制的测定
        3.2.2 单克隆抗体的制备与测定
            3.2.2.1 细胞融合
            3.2.2.2 杂交瘤细胞的检测与筛选
        3.2.3 抗体的纯化及鉴定
            3.2.3.1 抗体纯化前后浓度测定
            3.2.3.2 抗体纯度测定
    3.3 胶体金的制备及表征研究
        3.3.1 柠檬酸三钠添加量对胶体金溶液的影响
            3.3.1.1 柠檬酸三钠对胶体金溶液表观状态的影响
            3.3.1.2 胶体金溶液的可见光光谱分析
            3.3.1.3 胶体金颗粒大小的选择
        3.3.2 K₂CO₃添加量对胶体金溶液的影响
            3.3.2.1 K₂CO₃添加量对胶体金表观特征的影响
            3.3.2.2 胶体金溶液的可见光谱分析
    3.4 DHA金标检测卡的初步探究
        3.4.1 金标抗体的制备
            3.4.1.1 胶体金标记抗体最适pH的确定
            3.4.1.2 最适抗体标记量的确定
        3.4.2 金标记抗体效果的鉴定
        3.4.3 DHA金标检测卡的组装及性能测试
结论与展望
    结论
    展望
参考文献
致谢
个人简历
研究成果



本文编号：3921967