慢病毒转染荧光蛋白EYFP-H148Q/I152L细胞模型的构建

发布时间：2024-12-26 05:04

　　 目的构建稳定表达EYFP荧光蛋白的HeLa细胞作为阴离子(卤素)通道阻断剂筛选的细胞模型,为高通量筛选阴离子(卤素)通道阻断剂提供条件。方法通过基因重组技术构建表达YFP突变蛋白(EYFP-H148Q/I152L)和puromycin抗性的慢病毒载体。将慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞产生慢病毒颗粒,感染HeLa细胞,进一步利用抗性基因对细胞进行puromycin筛选,纯化细胞并扩增至所需细胞量。采用实时定量PCR和Western blot方法检测目的基因EYFP-H148Q/I152L的表达效率。并验证EYFP-HeLa稳转细胞系作为卤族离子通道阻断剂筛选模型的活性。结果基因测序验证了目的基因成功插入慢病毒载体。RT-PCR和Western blot检测结果显示,目的基因在HeLa细胞中实现了过表达。荧光显微镜下观察到EYFP-HeLa稳转细胞株能够表达特有的EYFP黄色荧光,效率接近100%。碘离子(I-)(低渗)溶液刺激细胞阴离子(卤素)通道的开放,内流的I-能够使黄色荧光淬灭。结论构建的EYFP-HeLa细胞系能够稳定表达EYFP黄色荧光蛋白,对内流入细胞的I...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 目的片段的扩增
    1.3 重组慢病毒载体的构建与鉴定
    1.4 病毒包装与滴度测定
    1.5 病毒载体感染和稳转细胞系的构建
        1.5.1 病毒感染
        1.5.2 稳转细胞系的构建
        1.5.3 稳转细胞系的RT-PCR检测
        1.5.4 稳转细胞系的Western blot检测
    1.6 EYFP-HeLa稳转细胞系作为卤族离子通道阻断剂筛选模型的活性验证
    1.7 统计学处理
2 结果
    2.1 慢病毒表达载体的构建与鉴定
    2.2 病毒滴度测定
    2.3 稳转HeLa细胞株的建立及RT-PCR和Western blot检测结果
        2.3.1 稳转HeLa细胞系中EYFP荧光效率
        2.3.2稳转HeLa细胞系的RT-PCR和Westernblot检测结果
    2.4 EYFP-HeLa稳转细胞系作为卤族离子通道阻断剂筛选模型的活性验证
3 讨论



本文编号：4020574