经动脉途径移植骨髓间充质干细胞对慢性肾病大鼠模型肾功能影响的研究
本文关键词：经动脉途径移植骨髓间充质干细胞对慢性肾病大鼠模型肾功能影响的研究
【摘要】：[目的]1、建立阿霉素诱导的慢性肾病大鼠模型,同时分离、提纯、培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并进行荧光标记。2、分别通过尾静脉途径和肾动脉途径输注标记后的BMSCs观察疗效,并探究大鼠经介入肾动脉插管治疗的可行性。[方法]取40只雄性SD大鼠切除左肾并通过尾静脉以2.5mg/Kg每周一次连续两周注射阿霉素,从而建立慢性肾病模型,同时处死大鼠后取肾脏组织行病理学检查。于此同时取2只SD大鼠,下肢备皮消毒后取出大鼠股骨及胫骨,并从其骨髓腔内提取BMSCs进行分离提纯培养后经流式细胞学鉴定确定为目标细胞后,传代培养并去除其中的杂质细胞和组织后取第4-6代BMSCs用携带绿色荧光蛋白的腺病毒转染进行标记。选取造模成功的36只SD大鼠随机分为三组,每组各12只大鼠：阿霉素慢性肾病模型对照组(ADR组)、经肾动脉途径移植BMSCs组(M-A组)、经尾静脉移植BMSCs组(M-V组),另取12只正常SD大鼠作为空白对照组(N组)。M-A组大鼠全麻下在透视观察下由左颈总动脉将PE-10导管小心缓慢插管至肾动脉,然后行肾动脉造影并缓慢注入浓度为1×106个/mLBMSCs混悬液2ml, ADR组在同样方法下经肾动脉注入2ml生理盐水,M-V组大鼠经尾静脉注射1×106个/mL BMSCs混悬液2ml,N组大鼠经尾静脉注入2ml生理盐水。检测移植后1d、7d、14d大鼠24 h尿蛋白、血红蛋白、血肌酐、血尿素氮、血清白蛋白改变情况,并在移植后三个时间节点各组分别取4只大鼠处死取肾组织行HE染色后光镜下观察、荧光共聚焦显微镜下观察大鼠肾组织病理学改变、BMSCs在肾脏分布情况以及检测水通道蛋白1(AQP1)及水通道蛋白2(AQP2)表达情况。[结果]造模后的大鼠24h尿蛋白显著升高,血肌酐、尿素氮急剧上升,血清白蛋白降低表现为低白蛋白血症和血红蛋白显著减少表现为明显贫血,病理学表现为肾间质片状纤维化及大量炎性细胞浸润表现、肾小球局灶节段性硬化、肾小管萎缩、部分肾小管上皮细胞脱落,通过实验室检查和病理学检查共同说明得到符合实验标准的动物模型。分离后培养的BMSCs表现出了典型的贴壁生长的特性。经过反复传代培养后得到纯度很高的BMSCs,显微镜观察细胞呈长梭形,形态均一,旋涡状生长,经流式细胞仪鉴定,其细胞表面标记表型抗原CD29、CD44、CD90呈高表达,而CD11b、CD34低表达。BMSCs经携带绿色荧光蛋白的腺病毒转染后其绿色荧光表达率为75%,形态和正常细胞一致,无明显改变。在经过处理后的第7d、14d各测量时间点上M-A组较M-V组和ADR组血红蛋白降低的程度减轻,贫血进程得到缓解；M-A组和M-V组较ADR组24h尿蛋白量明显减少、血尿素氮明显减低,血肌酐升高的程度和趋势降低,血清白蛋白降低的趋势减缓,差异均有统计学意义；M-A组较M-V组在短期内(14d以内)以上各项指标检查表现的差异更为显著,差异有统计学意义；ADR组在进行肾动脉造影后各项指标变化趋势属于正常波动范围,未引起严重的肾功能异常,说明并未发生对比剂性肾病。病理学检查提示：N组在各时间点病理学检查肾组织均表现正常：ADR组肾小球系膜细胞和基质不同程度增生,肾小球出现局灶节段性硬化,肾间质有片状纤维化及大量炎症细胞浸润；M-V组肾小球系膜细胞和基质增生程度较轻,肾间质可见局灶状纤维化及少量炎症细胞浸润；M-A组肾小球毛细血管襻扩张,肾小管无明显萎缩,肾间质纤维化不明显,炎性反应轻。荧光共聚焦显微镜提示：N组及ADR组在各时间点均无明显绿色荧光显示,M-V组和M-A组在移植后第1天均观察到绿色荧光显示,且逐渐增强,第14天时最强。M-V组绿色荧光仅分布在肾小管,而M-A组绿色荧光主要分布在肾小管,同时在肾小球系膜区可见少量分布。ADR组中AQP1及AQP2平均光密度数值明显升高,提示AQP1、AQP2过度表达；而M-A组和M-V组中AQP1及AQP2表达较ADR组明显下调,并且M-A组下调更为显著,差异有统计学意义,通过调节AQP1及AQP2的表达,进而维持了部分肾脏对水钠平衡及渗透压的调节,保护了肾功能。[结论]1、切除一侧肾以阿霉素诱导慢性肾脏病大鼠制作模型可行,并能减少造模时间及阿霉素用量,是安全、有效、可重复性强的一种稳定建造慢性肾病大鼠模型的方法。2、大鼠BMSCs易于取材,容易分离提纯培养,并能得到纯度高的细胞,同时鉴定方法简便,绿色荧光标记简单、可靠、发光稳定。3、移植BMSCs治疗阿霉素慢性肾病模型大鼠具有良好疗效,能在短期内能通过减少尿蛋白、减缓血清白蛋白、血红蛋白下降趋势、减慢血肌酐升高趋势、减少尿素氮、缓解贫血加重程度、下调AQP 1及AQP2表达进而维持部分水钠平衡,从而起到保护和改善肾功能的效果。通过病理学和荧光共聚焦显微镜观察发现BMSCs主要分布在肾小管区域并能改善肾小管功能。观察通过介入方式在无菌的条件下经左颈总动脉插管至肾动脉是一种可行的间接肾动脉插管方法,并且经肾动脉移植BMSCs能够取得更好的疗效,是安全可靠的方法。
【关键词】：阿霉素 慢性肾病 骨髓间充质干细胞 介入
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692;R-332
【目录】：
- 缩略词表(以字母顺序排列)5-6
- 中文摘要6-9
- 英文摘要9-12
- 前言12-17
- 材料与方法17-22
- 结果22-33
- 讨论33-38
- 结论38-39
- 参考文献39-42
- 综述42-49
- 参考文献47-49
- 攻读学位期间获得的学术成果49-50
- 致谢50
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