造血干细胞和单核细胞来源的树突状细胞在形态、表型及功能的对照实验研究

发布时间：2017-07-29 11:13

  本文关键词：造血干细胞和单核细胞来源的树突状细胞在形态、表型及功能的对照实验研究

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【摘要】：目的:本实验旨在探讨脐带血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞(CD34-DC)与外周血单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)在细胞形态、细胞表型、诱导生成的CTL细胞毒性方面的差异,并探讨不同来源的DC超微结构的变化与其抗原处理与抗原提呈功能之间的相关性,以期制备功能更加强大的DC疫苗。方法:取健康成人外周血,采用密度梯度离心法获取单核细胞后诱导生成DC(Mo-DC);取健康足月产孕妇脐带血,采用磁珠分选法分离纯化CD34+造血干细胞,并培养于含粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)/干细胞因子(SCF)的培养基诱导CD34+造血干细胞扩增及DC前体细胞的生成,GM-CSF/白细胞介素-4(IL-4)培养基进一步诱导前体细胞向DC细胞的分化(CD34-DC)。电镜下观察CD34-DC及Mo-DC的形态,比较其细胞突起数量、细胞核大小及内体小泡数量;流式细胞术检测不同培养时间(d1,d3,d5,d7)的CD34-DC及Mo-DC表面分子表达,并给予FITC-OVA257 264冲击,培养24小时后检测其抗原提呈能力;取培养至d5的CD34-DC及Mo-DC均负载CEA蛋白并加入肿瘤坏死因子(TNF-α)制备成CEA特异性的CD34-m DC、Mo-m DC(即DC疫苗),分别体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成,并利用MTS法检测其各自对CEA高表达的肿瘤细胞系Ls174-T的细胞毒性,以检测其激活T细胞的功能。结果:1光学倒置显微镜观察两种细胞来源的d0,d3,d7的CD34-DC、Mo-DC及负抗原后DC疫苗的形态学变化。D0时细胞均为圆形或椭圆形,且在细胞膜表面有微小突起,d3两种来源的DC均表现出树突状,Mo-DC突起较少且细长,呈梭形,而CD34-DC突起较多且粗短,d7 Mo-DC突起更加明显,且笔直,窄并伴以针尖状尾部,但CD34-DC突起相对较短且部分突起分叉,细胞膜粗糙不规整。整体来看,CD34-DC的突起形成比Mo-DC早。经过细胞因子和肿瘤抗原刺激之后的DC,悬浮生长而失去树突状外观,表现为类圆形,细胞膜清晰且光滑。2电镜观察CD34-DC、Mo-DC超微结构变化分别观察d3、d5、d7的CD34-DC、Mo-DC树突状突起数量、细胞核大小及内体小泡数量。CD34-DC的突起数量在d5上升、d7下降,而Mo-DCs的突起数量d3-d7是逐渐减少的。CD34-DC细胞核直径于d3、d5、d7分别为5.2±0.3、6.54±0.4、7.34±0.3,而Mo-DC为5.1±0.2、5.2±0.4、5.46±0.4,结果表明,培养7天后,CD34-DC细胞核比Mo-DC大(P0.05)。CD34-DC的胞浆内体小泡数量于d3、d5、d7分别为29.74±3.23、31.73±4.2、38.24±2.5,Mo-DC分别为:26.28±3.2、24.55±3.7、22.68±2.9,结果表明,培养7天后,CD34-DC的胞浆内体小泡数量比Mo-DC多(P0.05)。上述结果表明,与抗原提呈能力密切相关的内体小泡数量在CD34-DC中多于Mo-DC。3流式细胞仪检测不同来源的DC表面分子CD80、CD83、CD86表达率。Mo-DC表面CD80的表达率于d1-d7都极低,而CD83、CD86的表达率呈逐渐升高趋势,在经肿瘤抗原及促成熟细胞因子刺激生成Mo-m DC后三种分子均可迅速升高。CD34-DC表面CD80、CD83、CD86的表达率于d1-d7均呈逐渐升高趋势,经肿瘤抗原及细胞因子刺激生成CD34-m DC后表达率亦可迅速升高。Mo-m DC与CD34-m DC相比,三种表面分子表达率均无统计学差异(P0.05,P0.05,P0.05),说明Mo-DC与CD34-DC经抗原及细胞因子刺激生成的Mo-m DC与CD34-m DC均可成熟。4取培养d1、d3、d5、d7的CD34-DC、Mo-m DC,分别用FITC标记的OVA257-264冲击后,用流式细胞仪检测其在不同时间的抗原提呈能力。D1,CD34-DC中阳性细胞率为15.27%±1.47,Mo-DC只有5.16%±1.00。在d3、d5、d7,两种DC阳性细胞率均呈上升趋势,d7时,CD34-DC的阳性细胞表达率达到81.8%±1.5,而Mo-DC只有57.2%±1.4,CD34-DC较Mo-DC上升更加明显(P0.05),说明CD34-DC比Mo-DC具有更强的抗原提呈能力。5 MTS法检测DCs刺激同种异体T淋巴细胞的增殖能力。取两种来源的未成熟DCs按1:1分别与T淋巴细胞共培养4天,结果显示,以无DC刺激的T细胞作为对照,经CD34-DC刺激后T淋巴细胞增值率为208±39%,Mo-DC增值率为156±48%。两者无显著性差异(P0.05)。说明CD34-DC与Mo-DC在刺激同种异体T淋巴细胞的增殖能力方面无差异。6负载CEA生成的CD34-m DC与Mo-m DC疫苗分别激活的CTL对CEA高表达的Ls174-T肿瘤细胞的杀伤效率对比。CEA特异性CD34-m DC激活的CTLs(CC-CTLs)在效靶比为10:1、50:1、100:1时对LS174-T的杀伤率分别为63.3±1.52%、80.6±2.51%、90±2.0%。CEA特异性Mo-m DC疫苗诱导激活的CTLs(CM-CTLs)对LS174-T杀伤率分别为35±2.64%、53.6±3.21%、68.6±3.51%。结果显示,CC-CTLs及CM-CTLs都可以杀伤CEA高表达的肿瘤细胞Ls174-T,但CC-CTLs比CM-CTLs有更高的杀伤率(P0.05)。结论:1经GM-CSF/SCF培养基可诱导脐带血CD34+造血干细胞扩增及生成DC前体细胞,并在培养d8开始贴壁生长,每3天可收获一批DC前体细胞,用GM-CSF/IL-4培养基可进一步诱导生成CD34-DC,其表型与Mo-DC无差异。2脐血造血干细胞来源的CD34-DC具有更强的抗原提呈、促淋巴细胞增殖及诱导激活CTL的能力。3电镜下树突状突起数量、细胞核大小及内体小泡数量的变化是评估DCs功能差异的微观机制。4脐带血来源的CD34-DC有望成为制备DC疫苗新的、理想的原料细胞。
【关键词】：DC疫苗 脐带血 CD34+造血干细胞 抗原提呈 CTL 超微结构
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文词缩略表11-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-20
• 结果20-24
• 附图24-31
• 附表31-34
• 讨论34-36
• 结论36
• 参考文献36-39
• 综述 肿瘤免疫治疗的最前线—树突状细胞疫苗39-49
• 参考文献44-49
• 致谢49-50
• 个人简历50

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本文编号：588887