NDiV致病性初步研究及实时荧光PCR检测方法的建立

发布时间：2017-08-13 05:14

  本文关键词：NDiV致病性初步研究及实时荧光PCR检测方法的建立

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【摘要】：目的Nam Dinh virus(以下简称NDiV)是近年新发现的虫媒病毒,本课题组在国内首次成功从成蚊中分离,但该病毒流行病学意义和检测方法尚鲜见报道。本次研究拟建立一种特异、快速检测成蚊中NDiV的实时荧光定量PCR方法,为环境中的蚊虫携带NDiV的状况提供快速检测的方法提供参考。通过动物试验了解NDiV其致病作用,为指导虫媒传染病的控制提供依据。方法用C6/36细胞培养Nam Dinh病毒,待4-6天出现明显细胞病变时离心纯化病毒,50%细胞终点法测定病毒滴度。将已测定滴度的NDiV分离物分别在蚊虫细胞(C6/36细胞)和哺乳动物细胞培养,观察NDiV在不同细胞的生长状况。动物实验:(a)3-4日龄乳鼠,分组处理后在乳鼠脑部、腹腔和鼻腔接种不同剂量的病毒分离液,观察乳鼠接种病毒后的发病情况并作记录,提取发病组织研磨液核酸做RT-PCR检测并做病毒鉴定。(b)6日龄SPF鸡胚,分组处理后在SPF鸡胚卵黄囊、尿囊腔、羊膜腔接种不同剂量的病毒分离液,观察其孵育情况。(c)雏鸡,分组处理后在雏鸡的脑内接种、翅膀刺种和口服的途径接种病毒分离液,记录出现症状的雏鸡数。收集乳鼠和鸡胚的发病部位或组织,研磨后提取核酸做RT-PCR检测。以上实验均设立对照组。分析NCBI中的越南和中国的NDiV病毒株全序列特征,选取保守区域RdRp基因,设计NDiV的特异性引物与TaqMan-MGB探针,通过优化试验后验证所建立方法的特异性、敏感性、稳定性和应用性。建立特异性高、灵敏度强的实时荧光PCR快速检测方法。结果利用建立的RT-PCR方法检测NDiV分离物在蚊虫细胞(C6/36细胞)和哺乳动物细胞随时间的生长情况,检测结果显示病毒只在蚊虫细胞中有增殖,在哺乳动物细胞中无生长。NDiV对C6/36细胞有明显的病变效应,C6/36细胞是NDiV的敏感细胞;经C6/36细胞50%终点法计算得出NDiV病毒滴度为:1.41×106PFU/ml。乳鼠、鸡胚和雏鸡的不同部位经不同剂量的NDiV染毒后,没有出现明显的发病情况。通过多次的优化试验首次建立了NDiV MGB探针RT-PCR的检测方法。该检测方法用时短,灵敏度高,最低检测下限为1PFU/ml。该方法有良好的特异性,与登革热1-4血清型病毒、流行性乙型脑炎病毒、轮状病毒、人呼吸道合胞病毒、腺病毒、星状病毒无交叉反应;4份核酸含量不同的NDiV标准品重复测5次,Ct值的变异系数范围在1.67%~3.68%,有较高的稳定性。通过检测,龙岗区蚊虫NDiV携带率为18%,以居民区、医院和场馆的蚊虫携带NDiV比例最高,分别为22%、25%、31%。其它区域蚊虫携带NDiV比例较低。结论C6/36细胞是NDiV感染的敏感细胞,NDiV在C6/36细胞能产生病变效应,但病毒在哺乳类动物细胞未见增殖。通过实验观察发现,NDiV对乳鼠及鸡胚没有明显的致病作用。NDiV的TaqMan-MGB探针RT-PCR方法是一种特异、快速、灵敏高及稳定性好的方法,可应用于NDiV的流行病学监测工作,提高该病毒的快速检测的能力。
【关键词】：TaqMan-MGB Nam Dinh病毒 致病性 50%终点法
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-16
• 1．NDi V介绍10-14
• 1.1 NDi V的概述10-11
• 1.2 NDi V分子生物学特征11-13
• 1.3 NDi V与Cav V、DKNV关联性分析13-14
• 2．研究的意义和目的14-16
• 第一章 NDi V对动物致病性的研究16-27
• 1. 材料16-17
• 2. 方法17-20
• 2.1 标本处理17-18
• 2.2 NDi V株的获取途径和细胞传代18-19
• 2.2.1 细胞复苏18
• 2.2.2 细胞传代和培养18
• 2.2.3 NDi V在C6/36 细胞染毒和观察18
• 2.2.4 NDi V病毒滴度的测定（标准品的制备）18-19
• 2.2.5 NDi V在蚊虫及哺乳动物细胞中的培养19
• 2.3 NDi V对小鼠的致病性观察19-20
• 2.3.1 NDi V病毒对乳鼠的致病性19
• 2.3.2 NDi V对乳鼠脑部及各脏器大体形态学影响分析19-20
• 2.4 NDi V对鸡致病性20
• 2.4.1 NDi V对SPF鸡胚致病性20
• 2.4.2 NDi V对雏鸡的毒力试验20
• 3. 结果20-25
• 3.1 病毒分离结果20-21
• 3.2 NDi V病毒滴度测定结果21-22
• 3.2.1 NDi V在不同细胞的生长结果22
• 3.3 NDi V对动物的毒力结果22-25
• 3.3.1 细胞传代的病毒株对小鼠的致病性结果22-23
• 3.3.2 NDi V对乳鼠脑部及各脏器大体形态学影响结果23
• 3.3.3 NDi V对鸡胚的致病性结果23-24
• 3.3.4 NDi V对雏鸡的毒力结果24-25
• 4. 讨论25-26
• 5. 结论26-27
• 第二章 实时荧光PCR检测Nam Dinh病毒方法的建立及初步应用27-43
• 1. 材料27-29
• 2. 方法29-34
• 2.1 Rd Rp基因特异性片段筛选29-30
• 2.2 病毒核酸的提取30-31
• 2.3 实时荧光RT- PCR引物反应性实验31-32
• 2.4 测序验证32
• 2.5 Taq Man- MGB探针实时荧光PCR反应体系的建立和优化32-33
• 2.5.1 退火温度的优化33
• 2.5.2 酶用量的优化33
• 2.5.3 探针浓度的优化33
• 2.5.4 上下游引物浓度的优化33
• 2.5.5 Mg~(2+)浓度的优化33
• 2.6 Taq Man-MGB探针实时荧光PCR反应体系的评估33-34
• 2.6.1 特异性试验33-34
• 2.6.2 灵敏度实验34
• 2.6.3 稳定性实验34
• 2.7 龙岗区蚊媒携带NDi V的检测34
• 3. 结果34-41
• 3.1 PCR反应性结果34-35
• 3.2 RT-PCR产物测序验证结果35
• 3.3 Taq Man- MGB探针实时荧光PCR反应体系优化结果35-38
• 3.3.1 退火温度优化结果35-36
• 3.3.2 Taq DNA聚合酶用量优化结果36
• 3.3.3 Taq Man-MGB探针浓度的优化结果36-37
• 3.3.4 引物浓度的优化结果37-38
• 3.3.5 Mg~(2+)浓度的优化结果38
• 3.4 PCR应用性结果38-40
• 3.4.1 特异性实验结果38-39
• 3.4.2 灵敏度实验结果39-40
• 3.4.3 稳定性实验结果40
• 3.5 龙岗区蚊媒NDi V携带率结果40-41
• 4. 讨论41-42
• 5. 结论42-43
• 本文研究创新之处43
• 不足之处43-44
• 参考文献44-47
• 综述47-56
• 参考文献53-56
• 附录 156-57
• 附录 257-58
• 硕士期间发表的论文58-59
• 致谢59-60

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本文编号：665555