采用酵母双杂交技术筛选抗人CXCR4的单链抗体及其初步分析研究

发布时间：2017-08-15 12:05

  本文关键词：采用酵母双杂交技术筛选抗人CXCR4的单链抗体及其初步分析研究

  更多相关文章： CXCR4 酵母双杂交技术 单链抗体 癌症 蛋白纯化

【摘要】：目的:趋化因子受体4(CXCR4)的大小约40 kDa,是一种跨膜糖蛋白,是肿瘤干细胞的表面标记物。近年来研究发现CXCR4与多种肿瘤的发生、发展有着密切的关系。本文利用酵母双杂交技术从单链抗体文库中筛选抗CXCR4的单链抗体,将筛选的单链抗体进行蛋白纯化,为研究这些单链抗体在体内外的抗肿瘤活性奠定基础。方法:首先构建酵母双杂交体系中的诱饵质粒pGBKT7-CXCR4,将其转化到酵母菌株AH109内,在含有营养缺陷型的培养基中检测其自激活。将单链抗体文库转化到含有诱饵质粒的AH109内,并在SD/-Trp/-leu/-His+10mM3-AT培养板上对抗体文库进行筛选。将生长的候选阳性克隆在SD/-Trp/-leu/-His/-Ade+10mM3-AT培养板上进行划线筛选,将筛选的克隆分别回转到含有对照载体pGBKT7、含有对应抗原pGBKT7-CXCR4、以及含有无关抗原的AH109内。经过筛选,将最终得到的阳性克隆进行DNA测序及其分析。将单链抗体基因克隆到表达载体pET-28a-sumo内,将其转化到BL21菌体中进行包涵体蛋白纯化。采用ELISA技术检测纯化后的单链抗体与抗原CXCR4的结合能力。结果:(1)构建的诱饵质粒pGBKT7-CXCR4没有自激活作用。(2)采用CXCR4作为抗原筛选单链抗体文库,利用酵母双杂交技术最终筛选得到3个阳性单链抗体克隆,经过DNA序列分析确定为3个人的单链抗体,分别为aCX73、aCX82、aCX136。(3)将3个单链抗体基因克隆到表达载体pET-28a-sumo内,将其转化到BL21菌体内进行包涵体纯化,成功地纯化了其中2个单链抗体(aCX73、aCX82)。(4)采用ELISA检测表明:这2个单链抗体和抗原CXCR4具有较强的结合能力,可以用于将来的抗癌实验研究。结论:应用酵母双杂交技术从单链抗体文库中筛选到了抗CXCR4的单链抗体a CX73、aCX82、aCX136,纯化的aCX73、aCX82与抗原CXCR具有较强的结合能力,为将来一步研究这些单链抗体在体内外抗癌的研究奠定了较好的基础。
【关键词】：CXCR4 酵母双杂交技术 单链抗体 癌症 蛋白纯化
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R392
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 前言8-21
• 1.1 CXCR4的概述8-13
• 1.1.1 CXCR4和CXCL12的结构及功能8-9
• 1.1.2 CXCR4在肿瘤细胞内的表达情况9-10
• 1.1.3 CXCR4对肿瘤的作用10-13
• 1.1.4 CXCR4对肿瘤治疗的作用13
• 1.2 肿瘤干细胞的概念及特性13-15
• 1.2.1 肿瘤干细胞的来源13-14
• 1.2.2 肿瘤干细胞的特征14-15
• 1.3 单链抗体的概述15-17
• 1.3.1 单链抗体的表达方式15-16
• 1.3.2 单链抗体在治疗肿瘤上的应用16-17
• 1.4 酵母双杂交体系17-19
• 1.4.1 酵母双杂交的基本原理17
• 1.4.2 酵母双杂交的应用17-18
• 1.4.3 酵母双杂交的优缺点18-19
• 1.5 选题的目的、意义19-20
• 1.6 技术路线20-21
• 第二章 材料与方法21-40
• 2.1 实验材料21-28
• 2.1.1 实验仪器21-22
• 2.1.2 实验试剂22-23
• 2.1.3 细菌及质粒23-24
• 2.1.4 主要溶液24-28
• 2.2 实验方法28-40
• 2.2.1 诱饵质粒pGBKT7-CXCR4的构建28-29
• 2.2.2 将诱饵质粒pGBKT7-CXCR4转化到酵母AH109内及其自激活检测29-31
• 2.2.3 单链抗体文库的筛选31
• 2.2.4 候选阳性克隆的划线筛选31
• 2.2.5 将候选阳性克隆质粒进行回转验证31-33
• 2.2.6 阳性克隆的DNA序列分析33
• 2.2.7 含有单链抗体基因的表达载体的构建33-36
• 2.2.8 单链抗体的表达纯化36-39
• 2.2.9 采用ELISA检测单链抗体与抗原CXCR4的结合39-40
• 第三章 实验结果40-51
• 3.1 诱饵质粒pGBKT7-CXCR4测序鉴定40
• 3.2 AH109表型鉴定40-41
• 3.3 检测诱饵质粒pGBKT7-CXCR4的自激活作用41
• 3.4 单链抗体文库的筛选41-42
• 3.5 候选阳性克隆的划线筛选42-43
• 3.6 候选阳性克隆的回转验证43-46
• 3.7 阳性克隆的DNA序列分析46
• 3.8 含有单链抗体基因的表达载体的构建46-47
• 3.9 单链抗体的包涵体纯化47-50
• 3.9.1 诱导温度的优化47-48
• 3.9.2 采用WB验证单链抗体48
• 3.9.3 单链抗体的包涵体纯化48-50
• 3.10 检测单链抗体与抗原CXCR4的结合50-51
• 第四章 讨论51-54
• 4.1 抗原CXCR4的选择51
• 4.2 酵母双杂交技术的选择51-52
• 4.3 假阳性的排除52
• 4.4 阳性克隆的DNA序列分析以及单链抗体的表达纯化52-53
• 4.5 检测单链抗体与抗原CXCR4的结合53-54
• 第五章 结论和展望54-56
• 5.1 实验结论：54-55
• 5.1.1 诱饵质粒pGBKT7-CXCR4的鉴定54
• 5.1.2 利用酵母双杂交技术筛选抗CXCR4的单链抗体及初步分析54
• 5.1.3 阳性克隆的DNA序列分析、表达载体构建及其表达纯化54
• 5.1.4 单链抗体与抗原CXCR4的结合54-55
• 5.2 实验展望55-56
• 参考文献56-62
• 在学期间发表论文62-63
• 致谢63

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