SPATA12基因在氧化损伤中的作用及机制

发布时间：2017-08-20 02:23

  本文关键词：SPATA12基因在氧化损伤中的作用及机制

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【摘要】：正常生理情况下,细胞内的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平会维持在一定的范围内,并发挥其重要的生理功能。外源或病理因素会导致机体的氧化还原状态失衡,进而引起ROS的积累。ROS具有强氧化性,会对机体细胞的DNA、蛋白质(包括酶)、糖脂类等重要生物大分子进行攻击,阻碍其正常生理功能的发挥,引起细胞的氧化损伤。ROS引起的细胞损伤与人类大部分的疾病相关,如心血管疾病、神经退行性疾病、癌症和肺的纤维化等。因此,进行有关抗氧化的研究对了解或诊治这些疾病具有重要的意义。SPATA12(Spermatogenesis Associated Gene 12,SPATA12)是一个精子发生相关基因。在前期的工作中,本课题组发现SPATA12在紫外诱导的DNA损伤过程中发挥作用,这提示我们其可能也参与了氧化应激损伤修复过程。基于此,本文从以下三个方面探讨了SPATA12在抗氧化损伤中的作用。1.细胞氧化损伤模型的建立ROS主要包括超氧阴离子(O2-·)、羟自由基(OH·)和过氧化氢(H2O2)等,是引起细胞氧化损伤的重要因素。在本研究中,采用H2O2为氧化剂,以HeLa或MCF-7为实验材料,建立细胞氧化损伤模型。用0～70μM的H2O2处理细胞8 h,通过细胞形态学、MTT分析、生化检测等方法发现,随着H2O2浓度的升高,细胞的形态逐渐改变,存活率降低,细胞超氧化物歧化酶(SOD)的活力降低,谷胱甘肽(GSH)的含量减少；而脂质氧化产物(MDA)的含量上升,说明H2O2对细胞造成了氧化损伤。2.SPA TA12的抗氧化损伤功能及其作用机制基于上述细胞氧化损伤模型,采用定量PCR技术分析发现,在H2O2的作用下,SPATA12的表达明显上调,表明SPATA12能够响应氧化应激信号的诱导。通过双荧光素酶报告基因实验发现,转录因子AP-1参与了SPATA12应答H202刺激的生理过程,其位于SPATA12启动子区域的TRE元件发挥了重要作用。而HSF1 decoy ODNs实验结果表明,转录因子HSF1在SPATA12响应细胞氧化应激中的作用不明显随后,通过PI染色实验的分析表明,SPATA12能够抑制H2O2诱导的细胞凋亡；通过对氧化损伤相关指标的检测发现,SPATA12能够降低细胞内MDA和ROS的含量。这些结果表明,SPATA12可能具有抵抗H2O2诱导的氧化损伤的功能。3.抗氧化中药单体对SPATA12表达的影响通过MTT、定量PCR等方法,我们还检测了白藜芦醇、熊果酸、槲皮素和淫羊藿苷等四种具有抗氧化作用的中药单体对SPATA12表达的影响。结果显示,20μM浓度的白藜芦醇能够上调SPATA12 mRNA的表达,而其他中药单体不能明显提高SPATA12的表达。通过双荧光素酶报告基因实验进一步发现,转录因子AP-1的TRE元件在SPATA12应答白藜芦醇的过程中同样也发挥了重要作用。综上,本研究证实了SPATA12能够通过转录因子AP-1来应答外源ROS的刺激；初步发现SPATA12能够抵御H2O2所诱导的氧化损伤及细胞凋亡；发现抗氧化中药单体白藜芦醇能够激活SPATA12的表达,其可以作为SPATA12的候选激活剂。
【关键词】：SPATA12 H_2O_2 氧化损伤 AP-1 白藜芦醇
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 主要缩略词表11-13
• 第1章 绪论13-29
• 1.1 活性氧ROS的概述13
• 1.2 ROS的产生与清除13-17
• 1.2.1 ROS的来源13-15
• 1.2.2 ROS的清除系统15-17
• 1.3 ROS与氧化损伤17-19
• 1.3.1 ROS对脂质的影响17-18
• 1.3.2 ROS对蛋白质的影响18-19
• 1.3.3 ROS对DNA的影响19
• 1.4 ROS与细胞凋亡19-20
• 1.5 ROS与疾病20-23
• 1.5.1 自由基与心血管疾病21
• 1.5.2 自由基与肿瘤21-22
• 1.5.3 自由基与男性不育症22-23
• 1.6 氧化应激中的转录因子23-26
• 1.6.1 AP-123-24
• 1.6.2 HSF124-25
• 1.6.3 NF-κB25
• 1.6.4 Nrf225-26
• 1.7 中药单体与抗氧化损伤26-27
• 1.8 论文研究思路27-29
• 第2章 H_2O_2诱导细胞氧化损伤模型的建立29-39
• 2.1 引言29
• 2.2 材料与方法29-34
• 2.2.1 实验仪器29-30
• 2.2.2 材料与试剂30-31
• 2.2.3 实验方法31-34
• 2.3 结果与讨论34-37
• 2.3.1 H_2O_2对细胞形态的影响34
• 2.3.2 H_2O_2对细胞存活率的影响34-35
• 2.3.3 H_2O_2对细胞氧化损伤相关指标的影响35-37
• 2.4 本章小结37-39
• 第3章 SPATA12基因的抗氧化损伤功能及其作用机制39-58
• 3.1 引言39
• 3.2 材料与方法39-47
• 3.2.1 实验仪器39-40
• 3.2.2 材料与试剂40-41
• 3.2.3 实验方法41-47
• 3.3 结果与讨论47-56
• 3.3.1 H_2O_2对SPATA12表达的影响47-48
• 3.3.2 SPATA12通过AP-1结合位点应答H_2O_2的刺激48-53
• 3.3.3 SPATA12能够抑制H_2O_2导致的细胞凋亡53
• 3.3.4 SPATA12能够降低H_2O_2所致的MDA含量53-55
• 3.3.5 SPATA12能够抑制细胞内ROS的产生55-56
• 3.4 本章小结56-58
• 第4章 抗氧化中药单体对SPATA12基因表达的影响58-67
• 4.1 前言58
• 4.2 材料与方法58-61
• 4.2.1 实验仪器58-59
• 4.2.2 材料与试剂59-60
• 4.2.3 实验方法60-61
• 4.3 结果与讨论61-66
• 4.3.1 抗氧化中药单体对SPATA12表达的影响61-64
• 4.3.2 AP-1介导白藜芦醇激活SPATA12的转录表达64-66
• 4.4 本章小结66-67
• 结论67-69
• 参考文献69-78
• 附录A 攻读硕士学位期间发表的论文78-79
• 致谢79

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本文编号：704180