miR-9调控MYOCD在肝肺综合征相关PASMCs表型转换及异常增殖中的机制研究

发布时间：2017-10-11 11:47

  本文关键词：miR-9调控MYOCD在肝肺综合征相关PASMCs表型转换及异常增殖中的机制研究

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【摘要】：研究背景和目的:肝肺综合征(Hepatopulmonary syndrome,HPS)是一种致死性的终末期肝病相关并发症,其典型三联征为进行性慢性肝病(chronic liver diseases,CLD),肺内微血管扩张(intra-pulmonary microvascular dilation,IPVD)和难治性低氧血症(serious hypoxemia)。其在慢性肝病患者中的发病率较高(约为4%-47%),生存率较低(约为41%)。到目前为止,除了原位肝移植(liver transplantation,LT)肝肺综合征仍缺乏有效治疗。我们前期研究发现肝肺综合征大鼠血清能够刺激肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)的表型转换和异常增殖,两者作为肝肺综合征相关肺血管重建(pulmonary vascular remodeling,PVR)的典型病理变化具有重要的研究价值。心肌素蛋白(myocardin,MYOCD)作为血清应答因子(serum response factor,SRF)的转录水平激动剂,参与促进平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)相关表型基因表达;抑制细胞周期。研究证实,心肌素蛋白在心脏及大量成熟平滑肌细胞中均有表达。近来研究表明,心肌素蛋白在肺血管重建及多种增殖性血管疾病中发挥调控作用。microRNAs(miRNAs)作为一种非编码RNA,通过降解/转录抑制mRNA进而负性调控相关基因表达。这种转录后水平调控参与影响多种生物学过程,例如:细胞增殖及分化;特定细胞类型功能;多种心血管疾病。自从2007年第一篇关于miRNA调控VSMCs的文章发表后,相继miR-143/145,miR-21和miR-20a被证实在VSMCs生物学的多个方面发挥作用。然而,在HPS相关PVR中microRNA/MYOCD信号通路的调控作用尚不明确。因此,本研究拟探索是否存在miRNAs通过靶向调控MYOCD参与HPS的发生发展。实验研究方法(分为四步):1.构建体内CBDL动物模型及体外PASMCs模型采用慢性胆总管结扎(common bile duct ligation,CBDL)法构建大鼠HPS模型;从CBDL大鼠体内提取动脉血并制备血清。原代PASMCs细胞从正常SD大鼠体内提取,DMEM(低糖)+10%胎牛血清培养,4-9代用于后续实验。2.生物信息学分析;CBDL大鼠血清刺激下PASMCs内预测miRNAs、myocardin、分化表型相关蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表达水平检测运用相关生物信息学软件(Targetscan、miRanda和miRDB)预测靶向调控MYOCD mRNA 3’-UTR的miRNAs.正常大鼠血清或CBDL大鼠血清分别干预PASMCs24h(T1)、48h(T2)、72h(T3)后,qRT-PCR法检测选取的miRNAs(miR-1、miR-9、miR-128和miR-186)及myocardin mRNA的表达水平。Western blotting法检测myocardin和分化表型相关蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表达水平。3.miR-9的功能性分析PASMCs转染miR-9抑制剂,Western blotting法检测myocardin和分化表型相关蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表达水平。进而,采用qRT-PCR法和双荧光素酶报告基因系统验证miR-9与MYOCD的靶向调控关系。4.miR-9/MYOCD信号通路的功能性分析PASMCs分别转染miR-9抑制剂/MYOCD过表达质粒。Western blotting法检测分化表型相关蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表达水平;3H-Td R和CCK-8法检测PASMCs的增殖水平。实验结果:1.CBDL大鼠血清上调PASMCs内miR-9表达水平,下调myocardin mRNA及蛋白表达水平,诱导PASMCs表型转换。CBDL大鼠血清刺激下miR-9表达水平呈时间依赖性上调(2.8-、4-and 5.2 fold),miR-1上调(2-fold),miR-128及186表达水平没有明显改变;myocardin mRNA及蛋白表达水平呈时间依赖性下调;PASMCs内分化表型相关蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)表达水平呈时间依赖性下调。2.miR-9参与调控CBDL大鼠血清诱导的PASMCs表型转换。miR-9抑制剂有效上调CBDL大鼠血清刺激下PASMCs内myocardin和分化表型相关蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表达水平。3.miR-9靶向调控MYOCD mRNA。qRT-PCR法和双荧光素酶报告基因系统证实,miR-9通过直接靶向结合MYOCD mRNA 3’-UTR调控其表达。4.miR-9/MYOCD信号通路参与调控CBDL大鼠血清诱导的PASMCs表型转换及异常增殖。miR-9抑制剂/MYOCD过表达质粒均有效抑制CBDL大鼠血清刺激下PASMCs的表型转换及异常增殖。结论:miR-9通过靶向调控MYOCD参与介导CBDL大鼠血清诱导的PASMCs表型转换及异常增殖。
【关键词】：肝肺综合征 慢性胆总管结扎 microRNA 心肌素蛋白 肺动脉平滑肌细胞
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.3;R563
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-18
• 第二章 构建体内CBDL大鼠模型和体外PASMCs细胞模型18-26
• 2.1 构建体内CBDL大鼠模型和体外PASMCs细胞模型18-26
• 2.1.1 材料和方法18-22
• 2.1.2 实验结果22-24
• 2.1.3 讨论24-26
• 第三章 生物信息学软件预测及初步检测26-34
• 3.1 生物信息学软件预测及初步检测26-34
• 3.1.1 材料和方法26-30
• 3.1.2 实验结果30-33
• 3.1.3 讨论33-34
• 第四章 miR-9/MYOCD信号通路在肝肺综合征大鼠血清诱导的PASMCs表型转换和异常增殖中的作用和机制研究34-51
• 4.1 肝肺综合征大鼠血清诱导PASMCs表型转换34-40
• 4.1.1 材料与方法34-37
• 4.1.2 实验结果37-39
• 4.1.3 讨论39-40
• 4.2 miR-9 参与调控肝肺综合征大鼠血清诱导的PASMCs表型转换的影响40-43
• 4.2.1 材料与方法40-41
• 4.2.2 实验结果41-42
• 4.2.3 讨论42-43
• 4.3 miR-9 通过直接靶向结合MYOCD mRNA 3’-UTR调控其表达43-46
• 4.3.1 材料与方法43-44
• 4.3.2 实验结果44-45
• 4.3.3 讨论45-46
• 4.4 miR-9/MYOCD信 号通路参与调控肝肺综合征大鼠血清诱导的PASMCs表型转换和异常增殖46-51
• 4.4.1 材料与方法46-47
• 4.4.2 实验结果47-49
• 4.4.3 讨论49-51
• 全文总结51-52
• 参考文献52-60
• 文献综述 microRNA和lncRNA:血管损伤和重塑的重要调控因子60-68
• 参考文献64-68
• 攻读学位期间的研究成果68-69
• 致谢69

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本文编号：1012358