人支气管上皮细胞GCLC基因调控区AP-2元件的研究

发布时间：2017-10-13 13:23

  本文关键词：人支气管上皮细胞GCLC基因调控区AP-2元件的研究

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【摘要】：背景 氧化应激是许多急性或慢性肺部疾病的主要发病机制之一，严重危害了人类的健康。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是人体内重要的保护性抗氧化物质。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是体内合成GSH的限速酶，其由催化亚单位(GCLC)和调节亚单位(GCLM)组成。GCLC含有γ-GCS所有底物的结合位点和所有的催化亚基，故具有γ-GCS所有的催化活性。因此，GCLC基因表达水平将很大程度影响体内GSH的含量。本课题组前期的研究通过转录因子分析软件分析发现，人GCLC基因上游-790~-766区域内有AP-2转录调控元件与NF-κB转录调控元件。本实验将对AP-2（-784~-770）结合元件及NF-κB（-790~-785）结合元件的转录调控进行进一步的研究，有助于在分子生物学水平了解GSH的变化机制。 目的 分析人GCLC基因上游-790~-766区域内AP-2（-784~-770）元件及NF-κB（-790~-785）元件的作用，探索其可能的转录调控机制。从而部分阐明GSH水平变化的机制，为在分子生物水平阐明肺疾病发病机制提供一定的理论基础。方法 1设计四种含突变AP-2元件（-784~-770）的基因片段（-790~-766），并人 工合成对应的突变探针。采用电泳迁移率分析(EMSA)实验观察突变探针是否能与核蛋白特异性结合，并用超级迁移率实验（Supershiftassay）检测突变探针是否能与转录因子AP-2和NF-κB的抗体结合。2运用重叠PCR技术对AP-2元件（-784~-770）进行定点突变。并构建能 表达虫荧光素酶报告基因的突变型质粒。3将野生型质粒、突变型质粒分别与内参照质粒pRL-TK共转染16HBE细 胞，检测转染后虫荧光素酶活性值，以判断突变AP-2元件对人GCLC基因转录活性的影响。结果 1经过EMSA及Supershift试验筛选出其中一种含突变AP-2元件（-784~ -770）的基因片段（-790~-766）能与16HBE细胞核蛋白结合，但不能与转录因子AP-2抗体结合。 2经测序鉴定，，突变AP-2载体符合预期设计，成功构建。 3将成功构建的突变AP-2质粒与内参照质粒pRL-TK共转染16HBE细胞后检测虫荧光素酶活性值，结果发现突变AP-2（-784~-770）质粒较野生型质粒的荧光素酶活性明显下降(P＜0.01)，说明人GCLC基因转录调控区域AP-2元件（-784~-770）具有正性转录调控功能。 结论 1人GCLC基因转录起始位点上游-790~-766bp区间内有转录因子AP-2及NF-κB的转录结合位点。 2人GCLC基因转录起始位点上游的AP-2结合元件（-784~-770）具有正性转录调控功能。
【关键词】：谷胱甘肽 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位（GCLC） 基因突变 AP-2元件 人支气管上皮细胞（16HBE）
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R56
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 中英文对照词汇表9-11
• 前言11-15
• 第一部分 人GCLC基因转录调控区域（-790~-766）的AP-2元件和NF-κB元件的实验研究15-28
• 材料和方法15-22
• 1. 实验材料15-17
• 1.1 细胞株及细胞培养液15
• 1.2 主要试剂15-16
• 1.3 主要仪器设备16
• 1.4 主要溶液的配制16-17
• 1.4.1 细胞培养液16
• 1.4.2 细胞裂解液16
• 1.4.3 5×TBE储备液16-17
• 1.4.4 马来酸缓冲液17
• 1.4.5 20×SSC17
• 1.4.6 Washing缓冲液17
• 1.4.7 Detection缓冲液17
• 1.4.8 10×封闭液（blocking solution）17
• 1.4.9 抗体溶液（antibody solution）17
• 2. 实验方法17-22
• 2.1 16HBE（人支气管上皮）细胞系的复苏及培养17-19
• 2.1.1 细胞的复苏17-18
• 2.1.2 细胞的传代18
• 2.1.3 细胞的冻存18-19
• 2.2 电泳迁移率变动分析(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)19-22
• 2.2.1 EMSA的基本原理19
• 2.2.2 16HBE细胞核蛋白的提取（所有步骤都在冰上进行）19-20
• 2.2.3 探针的合成、退火、反应体系的构建20-21
• 2.2.4 电泳21
• 2.2.5 电转膜21-22
• 2.2.6 发光检测：先准备工作液（现配现用）1222
• 结果22-25
• 讨论25-28
• 第二部分 人GCLC基因转录调控区域（-784~-770）的AP-2元件突变载体的功能分析28-40
• 材料和方法28-36
• 1. 主要材料28-30
• 1.1 质粒和菌株28
• 1.2 细胞株及细胞培养液28
• 1.3 主要试剂28-29
• 1.4 主要仪器设备29
• 1.5 主要溶液的配制29-30
• 1.5.1 LB培养液29
• 1.5.2 LB固体培养基29-30
• 2. 实验方法30-36
• 2.1 人GCLC基因上游（-784~-770）调控序列突变AP-2荧光素酶报告载体的构建30-34
• 2.1.1 引物设计30
• 2.1.2 两轮PCR扩增并构建突变AP-2报告载体30-34
• 2.2 转染与荧光素酶活性分析34-35
• 2.2.1 16HBE细胞培养同第一部分34
• 2.2.2 双报道质粒瞬时共转染16HBE细胞34-35
• 2.2.3 荧光素酶活性检测35
• 2.3 数据分析及统计学处理35-36
• 结果36-38
• 讨论38-40
• 结论40-41
• 致谢41-42
• 参考文献42-47
• 攻读学位期间的研究成果47-48
• 综述48-54
• 参考文献52-54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 邹国明;李冰;冉丕鑫;;人支气管上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合酶催化亚单位基因转录的调控[J];中国病理生理杂志;2008年08期

本文编号：1025065