共刺激分子B7-H3对LPS诱导的急性肺损伤的免疫调节作用及其机制研究

发布时间：2017-10-21 02:15

  本文关键词：共刺激分子B7-H3对LPS诱导的急性肺损伤的免疫调节作用及其机制研究

  更多相关文章： LPS ALI 鼻腔滴注 B7-H3 LPS ALI 炎症因子 趋化因子 B7-H3 ALI LPS 中性粒细胞 凋亡 趋化

【摘要】：急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)作为一种肺部的炎症性损伤,是临床上较为常见的急危重症之一,具有高致死率和致残率的特点。如何有效预防和治疗ALI是临床上所面临的难题之一。B7-H3作为一个共刺激分子在固有免疫应答和调节中发挥重要的作用,但B7-H3在ALI中的免疫调节目前知之甚少。本研究通过建立内毒素诱导的小鼠ALI模型,探讨B7-H3在ALI发生发展中的调节作用,进一步阐明B7-H3对ALI的调节机制,以期为临床ALI的免疫治疗提供一个新的靶点。第一部分小鼠急性肺损伤模型的建立目的:建立一种成功率和存活率高的细菌脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤模型。方法:20只雄性BALB/c小鼠随机分为脂多糖组(LPS组)和生理盐水对照组。经鼻腔滴注LPS建立小鼠急性肺损伤模型,记录模型建立的成功率及小鼠的存活率。24h后,收集小鼠的肺组织和肺泡灌洗液(BALF),通过细胞计数和瑞氏染色明确BALF中的白细胞总数和中性粒细胞的数量,BCA法测定BALF中总蛋白的含量,ELISA法分析BALF中炎症因子及趋化因子的蛋白水平变化。实时定量PCR和ELISA法分别检测肺组织中炎症因子和趋化因子的m RNA和蛋白水平的变化。肺组织经HE染色于经光学显微镜下观察肺组织病理学改变。结果:HE染色发现LPS组小鼠肺组织出现不同程度的肺组织充血、微血管内皮损伤出血、炎性渗出、中性粒细胞浸润、肺泡壁增厚和破坏及透明膜形成等急性肺损伤的病理改变,而对照组的小鼠未见上述病理改变;较之于对照组,LPS组小鼠BALF中总细胞数和中性粒细胞数均显著增加(p0.01);与对照组相比,LPS组小鼠BALF中的总蛋白含量、炎症因子及趋化因子水平也发生明显升高(p0.05)。与对照组相比,LPS组小鼠肺组织中的炎症因子和趋化因子的m RNA和蛋白水平均发生明显升高(p0.01)。结论:经鼻腔滴注LPS构建了小鼠急性肺损伤模型,并证实该模型具有较高的成功率和存活率。第二部分共刺激分子B7-H3通过调节中性粒细胞的功能在急性肺损伤中的保护作用目的:通过已建立的小鼠急性肺损伤模型,分析共刺激分子B7-H3对LPS诱导的急性肺损伤的调节作用。方法:40只雄性BALB/c小鼠随机均分为:对照组、B7-H3单独处理组、LPS组和LPS+B7-H3联合处理组。采用鼻孔滴注LPS建立小鼠内毒素急性肺损伤模型,建模24h后,收集各实验组小鼠的肺组织和BALF。各实验组的肺组织经HE染色后经光学显微镜观察肺组织病理学改变;BCA法测定BALF中总蛋白的含量;通过细胞计数和瑞氏染色明确BALF中的白细胞总数和中性粒细胞的数量;通过髓过氧化物酶(MPO)试剂盒检测肺组织MPO活性;实时定量PCR和ELISA法检测肺组织中炎症因子和趋化因子的m RNA和蛋白水平变化;ELISA法测定BALF中炎症因子和趋化因子的蛋白水平变化。结果:HE染色结果发现采用B7-H3重组蛋白能减轻LPS诱导ALI模型肺组织的病理损伤程度、显著降低LPS诱导ALI模型BALF中白细胞数、中性粒细胞数和总蛋白的含量以及显著降低LPS诱导ALI模型肺组织中MPO的活性(p0.05);B7-H3能降低BALF和肺组织中趋化因子(CXCL2)的表达,与LPS相比差异有统计学意义,但不影响BALF中炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6表达的变化。结论:通过ALI模型的研究发现,B7-H3能减轻LPS诱导ALI模型肺组织的病理损伤程度,降低肺血管的通透性,抑制肺组织MPO活性,降低趋化因子的表达水平,进而发挥保护作用。第三部分共刺激分子B7-H3通过抑制中性粒细胞和巨噬细胞趋化对急性肺损伤的保护作用机制目的:探讨共刺激分子B7-H3对中性粒细胞和肺泡巨噬细胞的调控作用,分析B7-H3在急性肺损伤中的作用机制。方法:40只雄性BALB/c小鼠随机均分为:对照组、B7-H3单独处理组、LPS组和LPS+B7-H3联合处理组。建立小鼠急性肺损伤模型24h后,收集各实验组小鼠的BALF,流式细胞术检测BALF中的中性粒细胞凋亡情况。通过胶原酶消化法、贴壁法和磁珠分选获得小鼠肺内皮细胞、肺泡巨噬细胞和骨髓源中性粒细胞。分别在体外对中性粒细胞的凋亡、趋化及跨内皮迁移进行评价。同时采用流式细胞术分析LPS刺激后中性粒细胞表面CXCR2和Mac-1的表达水平;化学发光法检测活性氧(ROS)的生成;实时定量PCR及ELISA检测肺泡巨噬细胞中趋化因子CXCL2的m RNA和蛋白水平;流式细胞术检测肺泡巨噬细胞中NF-k B p65和MAPK p38的磷酸化水平。结果:在体内和体外模型中,B7-H3重组蛋白处理对中性粒细胞凋亡无影响,但能够显著降低LPS刺激后PMN的趋化能力,且PMN表面CXCR2的表达明显下调。B7-H3能够显著降低LPS刺激后PMN的跨内皮细胞迁移能力,且PMN表面Mac-1的表达也明显下调,能够显著抑制LPS刺激后ROS的释放。同时还证实B7-H3能够显著减少LPS刺激后肺泡巨噬细胞中CXCL2的表达,并且会导致NF-k B p65磷酸化水平的下调,但是对MAPK p38的磷酸化水平没有作用。结论:B7-H3重组蛋白不仅影响中性粒细胞的趋化作用、中性粒细胞跨肺内皮单层细胞的迁移作用、中性粒细胞的ROS产生,还影响肺泡巨噬细胞上趋化因子CXCL2的表达以及NF-k B信号通路中p65磷酸化水平。由此可见,B7-H3主要通过抑制中性粒细胞和肺泡巨噬细胞向肺损伤部位趋化,继而减轻肺损伤起到保护作用。
【关键词】：LPS ALI 鼻腔滴注 B7-H3 LPS ALI 炎症因子 趋化因子 B7-H3 ALI LPS 中性粒细胞 凋亡 趋化
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-15
• 第一部分 小鼠急性肺损伤模型的建立15-28
• 材料与方法15-21
• 结果21-26
• 讨论26-28
• 第二部分 共刺激分子 B7-H3 通过调节中性粒细胞的功能在急性肺损伤中的保护作用28-42
• 材料和方法29-32
• 结果32-39
• 讨论39-42
• 第三部分 共刺激分子B7-H3 通过抑制中性粒细胞和巨噬细胞趋化对急性肺损伤的保护作用机制42-58
• 材料和方法42-47
• 结果47-56
• 讨论56-58
• 全文总结58-59
• 参考文献59-64
• 综述64-74
• 结语68
• 参考文献68-74
• 中英文对照缩略词表74-75
• 攻读博士期间发表的论文75-76
• 本研究所获得的基金资助76-77
• 致谢77-78

【共引文献】

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本文编号：1070696