COPD与上皮细胞间质转化相关性研究

发布时间：2017-10-24 23:09

  本文关键词：COPD与上皮细胞间质转化相关性研究

  更多相关文章： COPD 动物模型 myh14 EMT CSE

【摘要】：目的:慢性阻塞性肺疾病(COPD)是常见的呼吸系统慢性病,具有高患病率及高死亡率等特点,其发病机制复杂,可能与多个基因变异相关,动物模型的建立与研究对了解其发病机制尤为重要。本研究旨在探索并构建新的小鼠COPD模型,并从小鼠一般状况、肺组织病理变化等多个方面对其进行评估。对上皮细胞间质转化(EMT)相关标志物(E-cadherin、α-SMA及collagen I)在COPD模型组及对照组中表达情况进行观察,并进行半定量PCR,初步筛选出与COPD相关的候选基因。在小鼠COPD模型、香烟烟雾提取物(CSE)刺激的人支气管上皮细胞(16HBE)及相应对照组中通过定量PCR、Dot bolt、Western blot及免疫荧光等检查,研究该候选基因在其中的表达情况;对myh14在COPD的发生发展中可能发挥的作用进行探讨,为将来进一步研究其在COPD中的具体作用机制打下基础。方法:1、通过采用CSE联合脂多糖(LPS)滴鼻建立小鼠COPD模型,将20只雄性C57/BL6小鼠随机平均分为正常对照组及COPD模型组,于建模第42天同时处死小鼠,每组随机选取6只小鼠进行后续实验。2、观察对照组及模型组的一般情况、肺组织病理变化(HE染色、PAS染色)、肺平均内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI),免疫组化观察EMT表现。3、对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞分类计数观察。4、用两组小鼠肺组织作为标本进行半定量PCR初步筛选出与COPD相关的候选基因。5、用定量PCR、Dot blot检测筛选出的候选基因(myh14)在小鼠肺组织中m RNA及蛋白表达水平。6、MTT法选择细胞实验中最适CSE刺激浓度,按CSE对细胞刺激的不同时间进行分组,用定量PCR及Dot blot检测myh14在各组细胞中m RNA及蛋白表达水平,并通过免疫荧光法观察各组细胞中myh14的分布与表达。7、Western blot检测Collagen I及α-SMA在COPD模型组及对照组肺组织中的蛋白表达水平。8、COPD模型组进行myh14与E-cadherin、α-SMA、Collagen I之间相关性分析。结果:1、一般情况:观察两组小鼠毛发,活动等情况,COPD模型组小鼠较对照组出现活动减少,消瘦,呼吸困难等表现,对照组小鼠存活率100%;模型组存活率为80%。2、肺组织病理学及形态结构变化:对照组气道及肺泡结构完整、清晰,较少炎性细胞浸润,肺泡间隔无明显增厚及断裂出现。模型组气道上皮结构紊乱,出现黏液高分泌,肺泡壁断裂并融合成肺大泡,有较多炎性细胞浸润。模型组MLI及DI均较对照组升高(P0.05)。3、BALF细胞分类计数:COPD模型组BALF中细胞总数、中性粒细胞比例均较对照组升高(P0.05)。4、免疫组化及相关性分析:对照组气道上皮细胞结构完整,胞浆内可见大量myh14阳性表达,而模型组myh14表达减少(P0.05);模型组E-cadherin较对照组减少(P0.05);模型组气道平滑肌增生较对照组明显;模型组气道壁胶原沉积明显,Collagen I表达较对照组增多(P0.05)。模型组气道上皮myh14、E-cadherin平均光密度值(IOD/area)较对照组减少(P0.05),模型组Collagen I平均光密度值(IOD/area)较对照组升高(P0.05)。平均光密度值相关性分析显示模型组myh14与E-cadherin呈正相关(r=0.967,P0.01),与Collagen I呈负相关(r=-0.925,P0.01)。5、半定量PCR筛选COPD相关候选基因结果:经过对两组小鼠肺组织进行半定量PCR COPD相关候选基因筛选,发现Slc9a2、Foxj1及Gif在两组中差异无统计学意义(P0.05),Chrm1、Sprr2b、Rag1、Dusp5、Cldn2、Cldn22、Scin差异有统计学意义(P0.05),Morc3、Rela、Akt1、Pik3r1、IL6ra、Myh14、Tpm3、Crabp2、Sprr2a2、Lyn、Srrm4、C/EBP、Gabarap、Elk1、Hk2、Tjap1、Strada两组间有明显差异(P0.01),选取差异明显的myh14作为COPD相关基因进行后续实验。6、CSE细胞毒性试验:对不同CSE浓度刺激24h的16HBE细胞进行MTT法检测各组细胞活性,在CSE浓度≤2.5%时,细胞活性降低不明显,差异无统计学意义(P0.05),当CSE浓度大于2.5%时,细胞活性出现明显下降(P0.01)。故选用2.5%CSE进行后续细胞实验。7、实时荧光定量PCR:myh14在小鼠COPD模型组中相对m RNA含量(RQ值)较对照组下降(P0.05),CSE对16HBE细胞不同时间刺激(8h、24h)组中myh14m RNA水平均较对照组下降(P0.01),CSE 8h及24h刺激组间存在差异,差异具有统计学意义(P0.05)。8、Dot blot、Western blot结果及相关性分析:Dot blot结果显示,COPD模型组myh14蛋白表达水平较对照组下降(P0.05),Western blot结果显示模型组中α-SMA及collagen I蛋白表达水平均较对照组升高(P0.05);相关性分析显示模型组中蛋白表达水平上myh14与α-SMA呈负相关(r=-0.833,P0.05),与collagen呈负相关(r=-0.953,P0.01)。16HBE细胞经CSE刺激(8h、24h)后,Dot blot显示myh14在蛋白表达水平上均较对照组明显下降(P0.01),CSE 8h及24h刺激组间存在差异性,差异具有统计学意义(P0.05)。9、16HBE细胞中myh14免疫荧光检测:绿色荧光为myh14在细胞中的阳性表达,myh14表达于细胞胞浆内,CSE刺激组(8h,24h)较对照组荧光表达明显减弱(P0.01),不同CSE刺激组间存在差异,且差异存在统计学意义(P0.05)。结论:1、CSE联合LPS滴鼻可成功构建小鼠COPD模型。2、COPD中存在EMT现象的发生。3、myh14可在人支气管上皮细胞及小鼠支气管上皮细胞表达,且在小鼠COPD模型及经CSE刺激的16HBE细胞中存在m RNA及蛋白水平下降。4、myh14可能在COPD发生EMT中起着重要作用,上调myh14的药物或许能抑制EMT的发生,这使得myh14可能会成为COPD等疾病药物治疗的新靶点。
【关键词】：COPD 动物模型 myh14 EMT CSE
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.9
【目录】：

• 中文摘要3-7
• 英文摘要7-12
• 前言12-15
• 材料与方法15-36
• 结果36-60
• 讨论60-66
• 结论66-67
• 参考文献67-71
• 英汉缩略词对照表71-72
• 致谢72-73
• 上皮细胞间质转化与慢性阻塞性肺病的研究进展（综述）73-85
• 参考文献79-85

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本文编号：1090949