Nogo-B在急性肺损伤肺泡上皮细胞凋亡中的作用

发布时间：2017-10-30 15:28

  本文关键词：Nogo-B在急性肺损伤肺泡上皮细胞凋亡中的作用

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【摘要】：背景:急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory dirstress syndrome,ARDS)在临床上表现为双肺弥漫浸润、肺顺应性下降、进行性及顽固性低氧血症,而肺部病理改变主要为血管扩张以及肺透明膜形成等。众所周知,ARDS是临床急危重症,而急性肺损伤(acute lung injury)通常认为是ARDS的早期表现,或是ARDS较轻的表现形式。在2012年的ARDS柏林标准中已将ALI其归入ARDS中。ARDS的发病率约为每年86.2/100000人次,有着相当高病死率,约为38.5%。脓毒症是与ARDS最为密切相关的危险因素中,也是ARDS最常见的病因。脓毒症所致的ARDS与细菌细胞壁组分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)密切相关,因而很多有关ALI/ARDS的研究均使用LPS作为动物或细胞学研究制造模型的工具。迄今为止,人们已经尝试了很多种药物及辅助治疗手段对ARDS进行治疗,但其中获得阳性结果的治疗手段寥寥无几,而药物治疗更是无一能够证实可改善该病的死亡率。这种临床的现实迫使我们对ARDS的发病机制及发展过程进行深入研究,从中发掘出潜在的治疗靶点及手段,以期将来某一天能攻克这一疾病。在病理生理学上,目前认为ARDS是机体遭受大量致病因素打击后所产生的广泛肺损伤。肺血管内皮-肺泡上皮屏障的受损在这种肺损伤中占据重要地位,肺血管内皮-肺泡上皮屏障受损导致其通透性增加,进而导致富含蛋白的渗出液-肺泡上皮屏障通透性增加还导致炎症细胞如白细胞等聚集于肺泡腔内加重炎症反应,这是ARDS时的核心病理生理变化。肺泡上皮细胞是构筑该屏障的重要组分,研究发现肺泡上皮细胞的过度凋亡与ALI/ARDS的发病相关。Nogo-B又称为网状蛋白4B,是近年来发现的具有调控炎症、组织修复等多种功能的一种蛋白质,定位于内质网上。进一步研究发现Nogo-B可通过参与调控内质网应激调控细胞的凋亡。现已证实Nogo-B在多种上皮细胞中均有表达,本实验室的前期研究也发现Nogo-B可表达于肺泡上皮细胞中。那么在LPS所致的肺泡上皮损伤过程中,Nogo-B究竟扮演一个怎样的角色,其是否并且如何参与到这个过程中目前并无相关报道。方法:首先我们通过LPS气管腔内滴注的方法构建小鼠ALI模型,分别使用反转录和实时定量荧光PCR的方法以及蛋白免疫印迹试验的方法观察Nogo-B mRNA及蛋白在该模型肺组织中的表达变化情况,同时使用lps刺激的mle-12及a549细胞株进行细胞学研究。通过这些实验我们的目的是明确和了解nogo-b是否有可能参与到ali/ards的发病及发展过程中。其次,我们分别使用nogo-b基因敲除小鼠和野生型小鼠再次复制构建小鼠ali模型,对两组小鼠生存时间进行生存分析,绘制生存曲线。并对这两种小鼠模型肺组织肺泡灌洗液总蛋白浓度以及肺组织湿/干重比这两项炎症指标进行检测,同时留取小鼠肺组织做石蜡切片、he染色进行病理学观察,通过对比以上观测指标,进一步了解nogo-b基因敲除与否对小鼠ali的病理生理学影响及其程度,确认nogo-b是否真正参与了ali/ards的病理生理学过程。再次,为明确nogo-b对ali/ards时肺泡上皮细胞损伤的影响是否是通过影响和调控其凋亡过程来达成的,我们使用凋亡细胞的原位末端转移酶标记法(tunel)对nogo-b基因敲除小鼠及野生型小鼠肺组织石蜡切片进行染色。通过观察对比,了解nogo-b基因敲除对ali时肺内细胞凋亡的影响。此后我们再对caspase-3活性及其活性蛋白片段表达的检测对上述凋亡进行量化及分析。为进一步明确nogo-b对上皮细胞凋亡的影响,我们在mle-12细胞株上进行小干扰rna敲减及lps刺激实验,重复上述对caspase-3活性及其活性蛋白片段表达量的检测与分析。最后,为明确nogo-b是否通过调控内质网应激进而调控ali时肺泡上皮细胞凋亡,我们在mle-12细胞上进行了研究。通过对比小干扰rna敲减nogo-b表达与未敲减nogo-b表达细胞之间caspase-8、9的表达变化,明确nogo-b对肺泡上皮细胞的凋亡影响是在内源性细胞凋亡通路上还是在外源性细胞凋亡通路上。为明确nogo-b是否通过调控内质网应激最终影响细胞凋亡的过程,我们选择一种内质网应激激活剂——衣霉素对细胞进行干预,通过对比分析上述两种不同nogo-b表达水平细胞暴露于不同浓度衣霉素之下后再遭受lps刺激后caspase-3、8、9以及内质网应激标记grp78的蛋白表达变化,最终明确nogo-b是否通过调控内质网应激参与到ali时肺泡上皮细胞的凋亡过程中。结果:一、ali动物模型和肺泡上皮细胞损伤中nogo-bmrna及蛋白质变化实时定量荧光pcr结果显示nogo-bmrna在ali小鼠模型中表达呈下降趋势。nogo-b蛋白表达情况与mrna表达情况一致,亦是在lps气管内滴注造模后呈下降趋势。通过这两项检测,我们可以明确在小鼠ali模型中,nogo-bmrna及nogo-b蛋白的表达均发生了变化,其变化趋势是在ali造模后呈逐渐下降的趋势,并且在12~48小时内其下降到一个比较明显的范围,统计分析也显示在此时间段内无论是mrna水平还是蛋白质水平,nogo-b的表达下降均有统计学意义。在上述两种细胞中nogo-bmrna表达量在0-48小时的时间范围内均呈下降趋势,但两种细胞株的下降的水平并不完全相同。与mrna结果一致,在两种细胞株接受lps刺激后,nogo-b蛋白表达量也呈随时间下降的趋势。二、nogo-b对小鼠急性肺损伤的保护作用生存分析显示,在使用致死剂量lps造模后,nogo-b基因敲除小鼠在6小时即出现第一只死亡的小鼠,而野生型小鼠在第22小时开始出现第一只死亡小鼠。nogo-b基因敲除小鼠绝大部分在ali造模后的20小时内死亡,而野生型小鼠的死亡时间集中于ali造模后20至40小时内。balf总蛋白测定的结果显示nogo-b基因敲除小鼠balf总蛋白含量明显高于野生型小鼠,提示nogo-b基因敲除小鼠肺血管内皮-肺泡上皮屏障破坏的程度高于野生型小鼠。同时肺组织湿/干重比测定的结果也与balf总蛋白的变化相吻合,野生型小鼠肺湿/干重比例低于nogo-b基因敲除小鼠。小鼠肺组织he染色则发现nogo-b基因敲除小鼠气管腔内滴注lps后肺泡间隔破坏、肺泡出血情况明显重于野生型c57bl/6小鼠。而在使用pbs气管腔内滴注作为对照的nogo-b基因敲除小鼠与野生型小鼠的对比中,以上三项指标均未出现明显的变化。三、nogo-b对急性肺损伤中肺泡上皮细胞凋亡的影响使用tunel染色观察到nogo-b基因敲除ali小鼠肺组织内肺泡上皮细胞凋亡远远重于野生型ali小鼠。而使用气管腔内滴注pbs的对照组小鼠并未出现明显的改变。ali造模后,小鼠肺组织caspase-3活性从呈逐渐上升的趋势,在12至48小时的时间段内,是其增加的高峰位置。使用westernblot方法检测ali造模后不同时间点小鼠肺组织内caspase-3活性片段也显示出类似的结果。敲减nogo-b表达后并使用lps刺激后24小时,mle细胞caspase-3活性以及caspase-3活性片段蛋白表达均明显高于pbs对照组。而在敲减nogo-b表达的细胞中,lps刺激后caspase-3活性及caspase-3活性片段蛋白表达量是最高的,且其与单纯用lps刺激的细胞相比其升高具有统计学意义。四、nogo-b调控内质网应激对肺泡上皮细胞凋亡的影响使用lps刺激细胞后24小时,mle-12细胞株中caspase-8活性片段表达较pbs对照组明显升高,而使用sirna敲减nogo-b基因表达组其caspase-8活性片段表达高于阴性sirna组。内质网应激标志grp78在ali小鼠肺组织中表达呈随时间进展逐步上升的趋势,在24-48小时的时间段内较为明显,而在lps刺激的mle-12细胞株中,grp78蛋白的变化趋势与之类似。nogo-b基因敲减表达+lps刺激与单独衣霉素刺激对凋亡及ers的影响是一致的,两者均使得caspase-3活性片段和grp78蛋白表达上升,而caspase-9活性片段蛋白表达变化不大。而且nogo-b基因敲减表达+LPS刺激+衣霉素暴露组中,其GRP78及Caspase-3活性片段表达有高于以上两组的趋势。结论:一、LPS气管腔内滴注所致的ALI小鼠模型肺组织中Nogo-B表达下降,LPS刺激的MLE及A549细胞中Nogo-B表达下降。因而可以Nogo-B在ALI中的表达出现了明显的变化趋势,提示其可能参与了ALI的病理生理过程。二、敲除Nogo-B基因可使小鼠在气管腔内滴注LPS造模后生存时间缩短,并且敲除Nogo-B基因可使ALI小鼠肺组织损伤程度加重。这进一步证实了Nogo-B在ALI的病理生理过程中发挥了一定的作用,可以明确Nogo-B的确参与了ALI的发病。三、敲除Nogo-B基因可使ALI小鼠肺泡上皮细胞凋亡增加,SiRNA敲减Nogo-B表达可使MLE-12细胞株在暴露于LPS刺激后凋亡增加。这些实验结果则明确了敲除Nogo-B可使ALI时肺泡上皮细胞凋亡增加,反过来Nogo-B有保护ALI时肺泡上皮细胞使其凋亡减少的作用。四、Nogo-B作用于外源性凋亡途径影响肺泡上皮细胞凋亡,在此细胞凋亡途径中,Nogo-B通过调控内质网应激进而调控细胞凋亡。
【关键词】：Nogo-B 急性肺损伤 肺泡上皮细胞 凋亡
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563.8
【目录】：

• 摘要5-9
• Abstract9-14
• 英文缩略词表14-17
• 前言17-20
• 第一部分 ALI小鼠模型和肺泡上皮细胞损伤中Nogo-B mRNA及蛋白质变化20-39
• 材料与方法21-30
• 结果30-37
• 讨论与分析37-38
• 小结38-39
• 第二部分 Nogo-B对小鼠急性肺损伤的保护作用39-52
• 材料与方法40-43
• 结果43-49
• 讨论与分析49-51
• 小结51-52
• 第三部分 Nogo-B对急性肺损伤中肺泡上皮细胞凋亡的影响52-66
• 材料与方法53-55
• 结果55-63
• 讨论与分析63-65
• 小结65-66
• 第四部分 Nogo-B调控内质网应激对肺泡上皮细胞凋亡的影响66-76
• 材料与方法66-67
• 结果67-73
• 讨论与分析73-75
• 小结75-76
• 总结76-77
• 参考文献77-83
• 综述83-95
• 参考文献91-95
• 附录95-96
• 致谢96

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本文编号：1118222