内源性抗菌肽Cathelicidins在慢性阻塞性肺疾病病理改变中作用的研究

发布时间：2017-11-04 18:16

  本文关键词：内源性抗菌肽Cathelicidins在慢性阻塞性肺疾病病理改变中作用的研究

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【摘要】：研究背景 慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是严重危害人类健康的常见病和多发病,因其患病率和死亡率高,造成沉重的社会经济负担,已成为全球重要的公共卫生问题。COPD是一种以气流受限为特征的慢性气道炎症性疾病,小气道重塑和肺气肿是引起气流受限的主要原因,探讨其形成机制,对于有效控制COPD病情进展,具有重要的意义。 抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是在动物防御系统中发现的一种多肽,由宿主基因编码,在天然免疫中发挥重要作用。AMPs主要分为两大家族：Cathelicidins家族和防御素家族。hCAP18/LL-37(以下简称LL-37)是人体Cathelicidins家族的唯一成员,既往的研究多集中于其抗菌作用,近年来的研究表明,LL-37在炎症反应、损伤修复、细胞增殖和凋亡等多种病理生理过程中也发挥重要作用。 我们的前期研究显示,COPD稳定期患者诱导痰中LL-37的表达较非COPD对照组显著增高,且LL-37的表达与诱导痰中炎症指标IL-8水平呈显著正相关,与患者第一秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%)呈显著负相关；进一步研究发现,COPD患者肺组织LL-37的表达显著高于非COPD对照组,LL-37主要表达于小气道上皮细胞、肺泡上皮细胞、炎性细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞)和成纤维细胞中。这些研究结果表明,异常高表达的LL-37可能参与了COPD的病理过程。 分析我们的前期研究结果可见,LL-37在COPD吸烟组患者肺组织小气道上皮细胞和肺泡上皮细胞中的表达显著高于吸烟对照组,而不吸烟对照组患者小气道上皮细胞和肺泡上皮细胞中LL-37的表达显著低于前两者。基于上述研究背景,我们提出以下问题：①COPD患者肺组织小气道和肺泡上皮细胞异常高表达的LL-37是否与小气道重塑和肺气肿的病理改变有关?②吸烟是否为诱导肺组织LL-37表达增高的重要因素?③COPD小气道上皮细胞高表达的LL-37怎样影响其周围的胶原沉积和组织重塑?④LL-37在小气道区和肺泡区均高表达,但却出现胶原过度沉积的小气道重塑和极少胶原沉积的肺气肿两种不同的病理改变,其原因是什么? 为了回答上述问题,我们进行了本课题的设计和研究。 目的 探讨内源性抗菌肽Cathelicidins在COPD小气道重塑和肺气肿病理改变中的作用及相关机制。 方法 1.观察COPD患者肺组织Cathelicidin (LL-37)的表达,分析其与COPD小气道重塑和肺气肿病理改变的关系。 (1)研究对象及临床资料收集： 选择因肺外周肿瘤行肺叶切除术的患者60例,其中稳定期COPD吸烟患者(COPD吸烟组)18例,肺功能正常的吸烟患者(吸烟对照组)22例,肺功能正常的不吸烟患者(不吸烟对照组)20例。术前收集性别、年龄和吸烟史等一般资料,并行肺功能检查,COPD的诊断按照慢性阻塞性肺疾病全球倡议(Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease, GOLD)标准。 (2)人体肺组织标本： ①HE染色测量小气道壁厚度、平均内衬间隔(mean linear intercept, MLI)和平均肺泡数(mean alveolar number, MAN),天狼猩红染色检测肺组织胶原沉积面积； ②免疫组织化学染色法检测肺组织中LL-37的表达； ③分析小气道区LL-37的表达与小气道壁厚度、胶原沉积面积的相关性,以及肺泡上皮细胞LL-37的表达与MLI、MAN的相关性。 2.烟熏法建立大鼠COPD模型,研究香烟烟气对大鼠肺组织Cathelicidin (rCRAMP)表达的影响,并分析Cathelicidin (rCRAMP)与大鼠小气道重塑和肺气肿病理改变的关系。 雄性Wistar大鼠72只,随机分为烟熏组和空白对照组,每组根据造模时间分为1月组、3月组和6月组,每组各12只。烟熏组大鼠每日置于烟气染毒柜中被动吸烟(南方牌香烟,焦油量：14mg,烟气烟碱量：lmg)两次,每次10支香烟持续30mmin,两次间隔时间不低于6小时。空白对照组大鼠不做特殊处理。造模过程中每隔2周对大鼠逐只称重,记录大鼠体重变化。各组大鼠造模结束后,对以下指标进行检测： (1)小动物肺功能仪检测气道阻力(RL)、肺动态顺应性(Cdyn)和潮气量(VT); (2)HE染色形态学测量小气道壁厚度、MLI和MAN,天狼猩红染色检测小气道区胶原沉积面积； (3)免疫组织化学染色法检测各组大鼠肺组织rCRAMP的表达； (4)分析大鼠肺组织小气道区rCRMP的表达与小气道壁厚度、胶原沉积的相关性,以及肺泡上皮细胞rCRAMP的表达与MLI、MAN的相关性。 3.建立人支气管上皮细胞与肺成纤维细胞共培养模型,研究支气管上皮细胞分泌的LL-37对肺成纤维细胞胶原表达的影响,并对其信号传导通路进行探讨。 (1)培养人支气管上皮细胞(16HBE),用不同浓度的香烟提取物(CSE)刺激后,免疫荧光染色法检测细胞中LL-37的表达。 (2)16HBE细胞与人肺成纤维细胞(HFL-1)在Transwell六孔板中共培养,给予不同浓度的CSE刺激后,ELISA法检测细胞上清液中LL-37的表达,Sircol法测定细胞上清液中胶原的表达。 (3)HFL-1细胞在Transwell六孔板下层培养,给予与步骤2相同浓度的CSE刺激后,Sircol法测定细胞上清中胶原的表达。 (4)不同浓度的LL-37合成肽、TGF-β1、乱码LL-37合成肽(sLL-37)刺激HFL-1细胞48h后,Sircol法检测细胞上清液中胶原的表达。 (5)不同浓度的LL-37合成肽刺激HFL-1细胞48h后,RT-PCR法检测细胞中I、III型胶原基因的表达。 (6)分别用甲酰肽样受体(formyl peptide receptor like1, FPRL-1)拮抗剂WRW4、ERK阻断剂PD98059、JNK阻断剂SP600125、p38MAPK阻断剂SB203580、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)阻断剂LY294002预处理HFL-1细胞2h后,再给予LL-37合成肽刺激48h, Sircol法测定细胞上清中胶原的表达。 (7)不同浓度的LL-37合成肽刺激HFL-1细胞不同时间,Western blot方法检测细胞裂解物中ERK和磷酸化ERK (pERK)的表达。 (8)分别给予FPRL-1受体拮抗剂WRW4、ERK阻断剂PD98059预处理HFL-1细胞2h后再给予LL-37刺激,Western blot方法检测细胞裂解物中ERK和pERK的表达。 4.检测COPD吸烟组、吸烟对照组和不吸烟对照组患者肺组织小气道区和肺泡区成纤维细胞表面标记蛋白,比较不同区域成纤维细胞细胞外基质蛋白的表达情况,探讨COPD患者肺组织成纤维细胞的异质性。 (1)采用免疫组织化学双染的方法检测肺组织成纤维细胞波形蛋白(vimentin)、E-钙粘素(E-cadherin)、CD45的表达,分析小气道区和肺泡区成纤维细胞的表型,并计算每种表型成纤维细胞所占的比例； (2)用免疫组织化学染色法对小气道区和肺泡区成纤维细胞I型胶原、Ⅲ型胶原、弹力蛋白、纤维连接蛋白的表达进行检测。 结果 1.(1) COPD吸烟组与肺功能正常的对照组患者在年龄上无统计学差异,COPD吸烟组与吸烟对照组患者吸烟指数无显著差异。COPD吸烟组患者FEV1%与FEV1/FVC均显著低于肺功能正常的对照组(P0.01,P0.01)。 (2)与对照组相比,COPD吸烟组患者小气道壁厚度显著增加,MLI显著增加,MAN显著降低(P0.01)。而上述指标在吸烟对照组和不吸烟对照组之间无统计学差异(P0.05)。 (3) COPD吸烟组患者小气道区胶原沉积面积较对照组显著增多(P0.01),而肺泡区胶原的表达显著低于对照组(P0.01)。 (4)免疫组化染色结果显示,LL-37主要表达于肺组织小气道上皮细胞、肺泡上皮细胞、炎症细胞(包括中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)和成纤维细胞。不吸烟对照组患者肺组织LL-37呈弱阳性表达,COPD吸烟组患者肺组织小气道区和肺泡区LL-37的表达显著高于吸烟对照组(P0.01,P0.01),吸烟对照组患者小气道区和肺泡区LL-37的表达显著高于不吸烟对照组(P0.01,P0.01)。 (5)小气道上皮细胞LL-37的平均光密度与小气道壁厚度和胶原沉积面积显著正相关(r=0.62, P0.01; r=0.73, P0.01);小气道粘膜下层LL-37阳性细胞数与小气道壁厚度和胶原沉积面积显著正相关(r=0.65, P0.01; r=0.71,P0.01)；肺泡上皮细胞LL-37的表达与MLI显著正相关(r=0.64,P0.01),与MAN显著负相关(r=-0.54,P0.01)。 2.(1)烟熏大鼠体重增长较正常大鼠明显延缓,烟熏6周后大鼠体重与空白对照组相比差异显著(P0.01)。 (2)与空白对照组相比,烟熏1月组大鼠RL和Cdyn均未出现明显改变(P0.05),烟熏3月组与烟熏6月组大鼠RL分别增加13.5%和21.9%,Cdyn分别下降18.1%和23.8%。烟熏组大鼠潮气量与空白对照组相比无显著差异(P0.05)。 (3)烟熏3个月后,大鼠出现小气道重塑及肺气肿的病理改变,表现为小气道壁增厚,小气道壁周围胶原沉积面积增加,肺泡间隔破坏,肺泡腔扩大,烟熏6个月后上述病理改变更加明显。形态学测量结果显示：烟熏3个月后,大鼠小气道壁厚度和胶原沉积面积较对照组显著增加,且烟熏6月组显著高于烟熏3月组。烟熏3个月后大鼠MLI显著增高,MAN显著降低。与空白对照组相比,烟熏6月组大鼠MLI增加70.7%,MAN下降48.9%。烟熏1月组大鼠小气道壁厚度、胶原沉积面积、MLI和MAN较空白对照组无显著差异(P均0.05)。 (4)烟熏1个月后大鼠小气道区和肺泡区rCRAMP的表达显著高于空白对照组,且随烟熏造模时间的延长,rCRAMP的表达逐渐增加(P0.01)。 (5)大鼠小气道区rCRAMP平均光密度与小气道壁厚度显著正相关(r=0.49,P0.01),与气道壁周围胶原沉积面积显著正相关(r＝0.50,P0.01)；肺泡上皮细胞rCRAMP平均光密度与MLI呈显著正相关(r=0.45,P0.01),与MAN呈显著负相关(r=-0.49,P0.01)。 3.(1)细胞免疫荧光染色结果显示CSE刺激后,16HBE细胞中LL-37的表达显著增强。 (2)CSE刺激后,16HBE/HFL-1共培养体系中LL-37的浓度增加,胶原的表达也增加,且LL-37中和抗体显著降低胶原的表达(P0.05)。 (3)CSE刺激后,HFL-1细胞上清液中胶原的表达无明显改变(P0.05)。 (4)LL-37合成肽可促进HFL-1细胞胶原的分泌,呈明显的浓度-效应关系。TGF-β1显著诱导胶原的产生,其诱导效应较LL-37合成肽更强。sLL-37合成肽对HFL-1细胞胶原的产生无明显影响(P0.05)。 (5)LL-37合成肽上调HFL-1细胞I型胶原和ⅡI型胶原mRNA水平,呈剂量-效应关系。 (6) FPRL-1拮抗剂WRW4预处理后,与LL-37合成肽刺激组相比,胶原的分泌显著下降,且与WRW4呈浓度依赖性。 (7) MAPK阻断剂和PI3K阻断剂预处理后,只有ERK阻断剂PD98059能显著抑制胶原的分泌(P0.05),其他通路抑制剂对胶原分泌无显著影响(P0.05)。 (8)LL-37合成肽可诱导ERK磷酸化,在作用30min时,磷酸化最明显,且LL-37合成肽对ERK磷酸化的诱导呈浓度依赖性；WRW4和PD98059可抑制LL-37合成肽诱导的ERK磷酸化。 4.(1)在不吸烟对照组和吸烟对照组患者的肺组织中只观察到一种表型的成纤维细胞(vimentin+CD45-E-cadherin-),即肺组织来源的成纤维细胞；在COPD吸烟组患者的肺组织小气道区仅观察到vimentin+CD45-E-cadherin-表型的成纤维细胞,而在肺泡区却观察到三种表型的成纤维细胞：vimentirE-cadherin+、vimentin+CD45+、vimentin+CD45-E-cadherin-,即上皮间质转化来源、循环纤维细胞来源和肺组织来源的成纤维细胞。其中vimentin+E-cadherin+表型的成纤维细胞约占24.3%, vimentin+CD45+表型的成纤维细胞约占12.4%,而大约63.3%的成纤维细胞来源于肺组织。 (2)与不吸烟对照组和吸烟对照组相比,COPD吸烟组患者小气道区I、Ⅲ型胶原、弹力蛋白、纤维连接蛋白的表达显著增高(P均0.01),而肺泡区I、Ⅲ型胶原、弹力蛋白、纤维连接蛋白的表达显著降低(P均0.01)。结论 1.COPD患者肺组织异常增高的Cathelicidin (LL-37)与小气道重塑和肺气肿的病理改变显著相关。 2.香烟烟气是诱导大鼠肺组织Cathelicidin (rCRAMP)表达增高的原因,rCRAMP与大鼠小气道重塑与肺气肿的病理改变密切相关。 3.CSE诱导支气管上皮细胞分泌的Cathelicidin (LL-37)可通过结合上皮下肺成纤维细胞表面的FPRL-1受体并激活ERK信号通路促进胶原表达,从而参与小气道重塑的病理过程。 4.COPD患者肺组织小气道区和肺泡区成纤维细胞存在明显的异质性；不同区域的成纤维细胞对高表达的LL-37反应不同,从而导致COPD患者不同区域的肺组织在相似的异常因子网络的环境下,产生不同程度胶原沉积的病理改变。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563.9

【参考文献】

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本文编号：1140566