丙酮酸乙酯对TDI哮喘气道炎症的影响及其作用机制

发布时间：2017-11-07 06:11

  本文关键词：丙酮酸乙酯对TDI哮喘气道炎症的影响及其作用机制

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【摘要】：研究背景及目的 支气管哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症,以气道非特异性炎症、气道高反应性及气道重塑为主要特征。在全世界范围内,约有3亿人患哮喘,我国目前约有2700万哮喘患者,据估计至2015年,将新增加1亿哮喘患者。 职业性哮喘属于支气管哮喘的一种,是由于接触工作环境中职业性致喘物后引起的气道疾病。临床表现为接触职业致喘物后出现的发作性胸闷、气短、喘息、哮鸣,常伴有咳嗽、咳痰等。近年来职业性哮喘发病人数有逐年增多的趋势,这主要由于合成化学工业的迅猛发展,不但使接触人数有所增加,同时也出现了前所未有的种类与数量极多的职业性变应原或半抗原物质。在工业环境里受到广泛关注的是甲苯二异氰酸酯(Toluene Diisocyanate, TDI)。据统计,长期暴露于TDI环境的人群,约有5%-15%发展为哮喘,而全球普通人群的哮喘患病率约为0.1%-8%,我国约为0.11%-2.03%。随着我国工业的发展,像TDI哮喘这样一些职业性哮喘的患病率也在逐年增加。 TDI为无色透明至淡黄色液体,有刺激性气味；遇光颜色变深,容易与包含有活泼氢原子的化合物：胺、水、醇、酸、碱发生反应。目前主要用来生产软质聚氨酯泡沫及聚氨酯弹性体、涂料、胶黏剂等。TDI哮喘的临床表现和病理变化与过敏性哮喘大致相同,但目前针对TDI哮喘的发病机制研究并不多,相关研究领域还比较局限,许多方面还不是很清楚。本实验第一个目的将试图建立一种可靠稳定的职业性哮喘模型研究TDI哮喘的发病机制及治疗措施。 既往研究证实哮喘是一种多基因的遗传性疾病。然而自1980年以来,哮喘发病率上升了将近1倍。这一现象不能完全用基因改变来解释,环境因素对基因易感人群的作用同样不可忽视。流行病学调查确认了许多哮喘的危险因素,如饮食中低抗氧化剂、吸烟、大气污染(柴油颗粒、NOX和臭氧等)以及反复的呼吸道病毒感染。因此环境因素和基因因素是相互作用的,当基因易感者的支气管上皮细胞失去对环境致病因素的抵御作用时,在上皮细胞局部就产生损伤,破坏气道上皮细胞屏障的完整性。支气管上皮细胞屏障主要包括支气管上皮细胞,及上皮细胞之间的连接装置。上皮细胞之间的连接方式有三种：紧密连接、黏附连接和缝隙连接,其中较为重要的是紧密连接和黏附连接。紧密连接主要位上皮细胞间隙腔面之顶端部,是细胞间最基本、最常见的组织结构形式。紧密连接分子由闭锁蛋白,紧密连接蛋白和连接黏附分子3种膜蛋白和闭合小环蛋白(ZO-1、Z0-2和ZO-3)等外周胞浆蛋白组成。紧密连接蛋白是紧密连接的骨架蛋白,并参与细胞间的信号转导。黏附连接由黏附蛋白如E-cadherin和a-连环蛋白、J-3连环蛋白、Y-连环蛋白组成的复合体。气道上皮细胞屏障破坏后可以通过释放各种介质在哮喘炎症的启动和维持中发挥重要作用。其中气道上皮粘附连接分子E-cadherin的作用备受关注。首先是它作为上皮屏障的一种连接蛋白,它可以调节紧密连接蛋白,如ZO-1, ocludin, claudin-2等紧密连接蛋白的生成与分布,而且还有学者发现E-cadherin可以抑制NF-kB的活性, NF-kB是哮喘气道炎症的募集关键信号通路：此外,气道上皮细胞干扰E-cadherin后,可以促进Th2细胞募集因子TRAC及促炎因子TSLP的表达,进一步有学者发现,上皮细胞连分子E-cadhein决定了上皮免疫耐受表型或者促炎表型。来自于纤维支气管镜活检获得的临床标本发现,E-cadherin在哮喘病人支气管上皮表达降低,且其降低的程度与疾病的严重程度正相关。我们的前期研究结果发现,TDI哮喘小鼠的气道上皮连接分子E-cadhein排列紊乱,提示E-cadherin参与了TDI哮喘的发病过程。保护气道上皮连接分子E-cadhein将为TDI哮喘的治疗提供一个方向。 丙酮酸乙酯(EP)是一种安全、稳定的脂溶性丙酮酸衍生物,在多种疾病动物模型中有抗炎抗氧化等器官保护作用,然而EP是如何发挥抗炎作用的目前尚不完全清楚。最近,有学者发现,EP可以通过保护肠连接蛋白ZO-1, occludin来改善LPS诱导的肠上皮损伤,提示EP可以通过减少紧密连接分子的破坏来减少肠上皮的损伤。但EP是否能保护气道上皮连接分子E-cadherin以及抑制TDI哮喘气道炎症目前尚无报道。因此,本实验的第二个目的将探讨EP是否可以减少气道上皮连接分子E-cadherin的破坏来抑制TDI哮喘气道炎症。 研究内容 第一部分：参考国外研究者的建立模型方法建立TDI诱导的哮喘小鼠模型 第二部分：在此模型的基础之上给予EP干预(腹腔注射),观察气道上皮连接分子E-cadherin的表达变化。 第三部分：在此模型的基础之上给予EP干预(腹腔注射),观察哮喘炎症变化情况。 材料与方法 SPF级雄性BALB/c小鼠45只6-8周龄,体重为20±2g(购于南方医科大学实验动物中心),随机分为3组：(1)对照组(A00组,A00为丙酮+橄榄油,是TDI的溶剂)；(2)实验组(TDI组)；(3) TDI+EP干预组(EP组)。AS-D试剂盒、丙酮、橄榄油、TDI(sigma); IgE(ALPCO);小鼠白细胞介素-4(IL-4)γ-干扰素(IFN-γ), IL-1β TNF-a试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；MPO试剂盒、HE染液,PAS染液(南京建成)。E-cadherin一抗(santa cruz)。 HMGB1一抗(Abcam),DAB显色试剂盒(北京中杉金桥)。 1.动物模型的制备 BALB/c小鼠在南方医科大学实验动物中心SPF级条件下饲养。A00组：第1天、第8天致敏。具体方法：将丙酮和橄榄油的混合液(体积比为2：3)20微升滴到小鼠耳背部,40微升／只小鼠；第15天,第18天,第21天给予雾化吸入激发。具体方法：将小鼠放进雾化箱,用枪将丙酮橄榄油混合液(体积比为1：4)放进雾化装置,持续雾化2小时。每次激发前1h按100mg/kg剂量腹腔注射生理盐水。TDI组：第1天,第8天致敏。具体方法：0.3%TDI20微升(丙酮和橄榄油体积比为2：3)滴到小鼠耳背部,40微升/只小鼠；第15天,第18天,第21天给予雾化吸入激发,具体方法：将小鼠放进雾化箱,用枪将3%TDI(丙酮和橄榄油体积比为1：4)放进雾化装置,持续雾化2小时。每次激发前1h按100mg/kg剂量腹腔注射生理盐水。EP组操作过程同TDI组,每次激发前1h按100mg/kg剂量腹腔注射EP。 2.气道高反应性检测 小鼠气道高反应性于第3次激发后24h检测,乙酰甲胆碱依次由低浓度开始激发(浓度分别为0、3.12、6.25、12.5、25mg/ml),每个浓度雾化后检测2min,观察小鼠反应,BUXCO无创肺功能检测仪记录小鼠气道反应性监测指标(Penh enhanced pause)。 3.取血 测量小鼠肺功能结束后24h,麻醉小鼠,给予小鼠眼球摘除,取血,将全血放置1h后,3000转/分,离心20分钟,取上清,-80℃保存备用。按照说明书测血清IgE的含量. 4.淋巴细胞培养 将A00组、TDI组小鼠耳后淋巴结分别放入1.5mlEP管,所有EP管均置于冰上,加入1.0mlPBS.摘取淋巴结结束后,将EP管中淋巴结转移至100目滤网上,眼科镊轻轻挤压,10mlRPMI-1640冲洗,15m1离心管收集冲洗液,10微升冲洗液计数细胞,剩余冲洗液1000转/分,离心3分钟,倒掉上清液,用RPMI重悬至细胞浓度为107/ml,准备48孔板,每孔加入900微升RPMI-1640(10%FBS,5.0mg/1刀豆素蛋白A),将100微升的细胞悬液加入其中使得细胞浓度为106/ml。37℃培养40小时。培养结束后取培养液1000转/分离心10分钟,上清分装-80℃保存待测。 5.支气管肺泡灌洗细胞分类计数及检测IL-1β、TNF-α 淋巴结摘除完成后,气管切开,留置针置入,缝线固定,0.8mlPBS灌洗,反复2次,回收率在80%左右,1200r/min离心10min,上清用于检测IL-1β、TNF-a.离心沉淀细胞用0.2m1PBS重悬,取0.01m1在血细胞计数器下计算细胞总数,其余沉渣细胞涂片经HE染色,按细胞形态进行分类计数(至少计数200个细胞)。 6.肺组织病理学观察 肺泡灌洗完成后,迅速取左肺10%多聚甲醛灌注固定24h,经脱水,透明,石蜡包埋,切片后行HE染色、PAS染色及AS-D染色,光镜下光镜观察支气管粘膜炎性细胞浸润、上皮细胞增生情况等病理改变以及上皮细胞基底膜中性粒细胞浸润情况。 7.免疫组化及蛋白印迹 按照免疫组化染色试剂盒说明操作,一抗为浓缩型兔多克隆亲和纯化E-cadherin抗体以及兔多克隆亲和纯化HMGB1抗体(稀释度1：100).阳性细胞着色表现为染成棕褐色。提取右肺组织蛋白,变性,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜2h,5%脱脂奶粉封闭2h, E-cadhein一抗4℃过夜,抗兔荧光二抗常温孵育1h, Odyssey(?) CLx显影。 8.肺组织MPO活性检测 按照MPO试剂盒说明书操作,检测肺组织中MPO的活性。 9.统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计分析,资料以均数±标准差表示,多组间总体均数比较在方差齐时采用单因素方差分析one-way ANOVA,方差不齐时用Welch校正检验,以p0.05为有统计学意义。 结果 1.EP对小鼠肺功能的影响 随着乙酰胆碱浓度上升各组小鼠气道反应性检测指标%基线Penh值均出现上升趋势,TDI组小鼠的气道反应性最高。乙酰胆碱浓度为3.12、6.25、12.5、25mg/ml时,TDI组小鼠气道反应性比对照组高(P0.05)；乙酰胆碱浓度为6.25、12.5、25.0mg/ml时,100mg/kg组显著降低小鼠气道反应性(P0.05)。 2.EP对小鼠肺泡灌洗液ELISA法检测IL-4,淋巴结上清检测IgE.IFN-γ的作用 三次激发之后,TDI组Thl炎症因子IFN-γ、Th2炎症因子IL-4及血清IgE均高于A00组(167.92±7.56pg、ml vs37.47±5.27pg/ml:272.66±4.79pg/ml vs20.48±2.18pg/ml:431.78±16.205pg/ml vs331.26±0.4119pg/ml),差异有统计学意义(P0.05),腹腔注射100mg/kg EP能够减少IFN-γ、IL-4及IgE的释放,与TDI组有统计学差异(92.11±4.91pg/ml vs167.92±7.56pg/ml:170.63±4.05pg/ml vs272.66±4.79pg/ml:345.67±2.21vs431.78±16.21pg/ml)(P0.05). 3.EP对小鼠支气管肺泡灌洗液炎症细胞的作用 三次激发之后,TDI哮喘组肺泡灌洗液细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞计数显著增高,与A00组比较,差异显著(P0.05).100mg/kg EP干预组肺泡灌洗液细胞总数、嗜酸粒细胞、中性粒细胞数目较TDI组减少(P0.05),但仍高于A00组。 4.EP对HMGB1、IL-1β、TNF-a及MPO的作用 三次激发后,TDI组HMGB1、IL-1β及MPO的水平较AOO组显著增高(IL-1β:27.7±2.8443pg/ml vs5.4833±0.7855pg/ml:MPO:4.7567±0.5767u/g vs2.09±0.3179u/g)(P0.05),EP100mg/kg干预后,能减少HMGB1、IL-1β及MPO的释放(IL-1β:2.9714±0.9255pg/ml vs27.7±2.8443pg/ml:MPO:2.3967±0.1126l/g vs4.7567±0.5767u、g)(P0.05).TNF-a没有检测到。 5.EP对小鼠肺组织病理改变的作用 对照组：支气管、肺泡、血管结构正常完整,支气管壁周围无炎性细胞浸润,支气管上皮无增生分化,无脱落。TDI组：气道上皮脱落,上皮细胞增生,粘液分泌增加,管壁周围可见大量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润。与TDI实验组对比,100mg/kg EP干预之后气道-血管壁周围中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润减少,炎症明显减轻。气道上皮增生分化明显减弱。 6.EP对小鼠气道上皮连接分子E-cadherin的影响 用免疫组化及蛋白印记检测肺组织气道上皮连接分子E-cadherin的表达。免疫组化结果显示A00组小鼠气道上皮细胞连接分子E-cadherin呈棕黄色,表达在细胞与细胞之间的连接处,细胞浆极少表达。TDI哮喘组小鼠气道上皮增生,E-cadherin表达减少,排列混乱,上皮细胞浆可见部分棕黄色。100mg/kgEP干预后,气道上皮细胞增生减弱,E-cadherin破坏减少,排列部分恢复正常。蛋白印记结果也显示TDI哮喘组小鼠的气道上皮连接分子E-cadherin表大量减少,100mg/kg EP干预后能部分恢复E-cadherin的表达量。 结论： 1：我们成功的建立TDI诱导的哮喘模型 2：EP可以改善TDI哮喘小鼠支气管上皮连接分子E-cadherin的破坏 3：给予EP干预对TDI哮喘气道炎症具有抑制作用,有可能是通过上调E-cadherin的表达发挥抑制炎症作用的。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R562.25

【参考文献】

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本文编号：1151171