Paralemmin-3在内毒素诱导的急性肺损伤中的作用及其机制研究

发布时间：2017-11-11 02:07

  本文关键词：Paralemmin-3在内毒素诱导的急性肺损伤中的作用及其机制研究

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【摘要】：研究目的构建靶向大鼠paralemmin-3(PALM3)基因的短发夹RNA(shRNA)重组腺病毒载体,以所构建的重组腺病毒载体感染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞和大鼠,在体内和体外实验中探讨PALM3在LPS诱导的急性肺损伤中的作用;同时利用免疫共沉淀检测LPS刺激后PALM3是否与TLR4信号通路中的接头分子MyD88、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6存在相互作用,以探讨下调PALM3表达对急性肺损伤保护作用的分子机制。研究方法1.靶向大鼠PALM3基因的shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定按RNAi设计原则,分别设计3条针对大鼠PALM3基因的shRNA,插入穿梭质粒pGV120-EGFP,并行PCR、测序鉴定,采用AdMAXTM包装系统将穿梭质粒pGV120-EGFP和骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转入包装293细胞中,包装出靶向大鼠PALM3基因shRNA重组腺病毒载体Ad.PALM3-shRNA-1,Ad.PALM3-shRNA-2,Ad.PALM3-shRNA-3,扩增并纯化重组腺病毒后采用TCID50法测定病毒滴度。通过酶消化法分离大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ),经差速离心和免疫黏附法纯化AECⅡ,进行原代培养并采用肺表面活性物质相关蛋白C(SP-C)对AECⅡ鉴定。针对不同PALM3靶序列的重组腺病毒(Ad.PALM3-shRNA-1,Ad.PALM3-shRNA-2,Ad.PALM3-shRNA-3)分别转染AECⅡ细胞,荧光显微镜下观察转染效率并确定感染复数(MOI)值,Western Blot检测AECⅡ中PALM3蛋白的表达水平,评价三组重组腺病毒的干扰效率,选择干扰效率最佳的重组腺病毒用于后续实验。2.干扰PALM3表达对大鼠内毒素性急性肺损伤的保护作用依据第1部分实验结果,选择干扰效率最佳的Ad-PALM3-shRNA-1用于后续实验。用经鼻滴注的方法,以3×108PFU/只的剂量的建立大鼠重组腺病毒ad.palm3-shrna感染模型组(ad.palm3-shrna组),同时用空病毒载体ad-egfp(ad.egfp组)和pbs(control组)作为对照。感染48h后,以lps(10mg/kg)腹腔注射复制内毒素性急性肺损伤模型。在lps刺激后的0h、3h、6h、12h、24h和48h各时间点分别用rt-pcr和westernblot检测palm3mrna和蛋白表达情况;同时对比各组间的肺组织病理改变以及模型大鼠的7d存活率的变化;用elisa法分别检测各组肺泡灌洗液中和血清中的tnf-α、il-1β、il-6及mpo表达水平的变化;用elisa法检测肺组织匀浆中核转录因子nf-κb的活性变化。3.干扰palm3表达抑制lps诱导的大鼠aecⅡ细胞炎症反应依据第1部分实验结果,选择干扰效率最佳的ad-palm3-shrna-1用于后续实验。以大鼠aecⅡ细胞为实验对象,实验共分为3组:ad.palm3-shrna组(转染重组腺病毒ad.palm3-shrna-1),ad.egfp组(转染空腺病毒载体ad.egfp)及control组(加入等体积pbs)。转染48h后,3组细胞均给予lps(10μg/ml)刺激,lps刺激后0h,3h,6h,12h,24h,48h收集细胞和细胞上清液,分别应用westernblot及pcr检测三组细胞中palm3蛋白和mrna表达水平,用elisa法分别检测各组细胞上清液中炎性因子tnf-α、il-1β和il-6的表达水平及细胞内核转录因子nf-κb活性。4.验证palm3是否与lps-tlr4信号转导通路中的接头分子存在相互作用研究结果1.成功构建了三组靶向大鼠PALM3基因sh RNA的重组腺病毒载体:Ad.PALM3-sh RNA-1、Ad.PALM3-sh RNA-2、Ad.PALM3-sh RNA-3,感染滴度分别是3×1010pfu/ml、2×1010pfu/ml和3×1010pfu/ml,均符合实验要求;AECⅡ细胞原代培养成功,细胞生长状态良好,经SP-C免疫荧光鉴定成功。重组腺病毒转染AECⅡ后24h可见绿色荧光表达,48h荧光强度最高,最佳MOI值为200。三组重组腺病毒以相同MOI值转染AECⅡ48h后,与正常细胞及空白对照组相比,抑制PALM3蛋白表达被抑制,其中Ad.PALM3-sh RNA-1的干扰效率最佳备选用于后续实验。2.正常大鼠肺组织中存在PALM3的表达,LPS诱导大鼠急性肺损伤模型中肺组织内PALM3的表达增加。与Control组及Ad.EGFP组相比,Ad.PALM3-sh RNA组LPS腹腔注射后各时间点大鼠肺内PALM3的表达下调(P0.05);与Control组及Ad.EGFP组相比,Ad.PALM3-sh RNA组大鼠肺组织的病变减轻、血清中及肺泡灌洗液中炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO表达水平下降、肺组织中NF-κB活性降低、肺损伤大鼠7d存活率显著提高(P0.05)。3.给予内毒素刺激后,随着作用时间的延长,大鼠AECⅡ中的PALM3的表达增加,重组腺病毒Ad.PALM3-sh RNA转染后成功下调AECII中PALM3的表达(P0.05);给予LPS刺激后,与Ad.EGFP组和Control组相比,Ad.PALM3-sh RNA组细胞炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量减少,核转录因子NF-κB的活性受抑(P0.05)。4.在AECII细胞中给予LPS刺激与否,均存在PALM3、My D88、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6五种蛋白的表达;CO-IP结果证实PALM3与IRAK-1存在天然相互结合,并不依赖于LPS刺激,而给予LPS刺激后,在大鼠ACEⅡ中PALM3能以配体依赖的方式与TIACM-2、TRAF-6相互结合。结论1.干扰PALM3表达能减轻内毒素诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞炎症反应,对内毒素性大鼠急性肺损伤具有保护作用;2.PALM3可能是参与LPS-TLR4信号通路转导的关键接头分子之一,下调PALM3表达对ALI的保护作用可能是通过阻碍LPS-TLR4信号通路转导而实现的。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563

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