γ分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路对BMSCs向肺泡上皮细胞分化的影响

发布时间：2017-11-15 20:15

  本文关键词：γ分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路对BMSCs向肺泡上皮细胞分化的影响

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【摘要】：目的:骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源广、易培养且具有诱导其定向分化目的细胞的潜能,在BMSCs分化的过程中有许多信号通路参与并发挥重要的作用,而Notch信号通路就是其中的一条。本实验利用骨髓间充质干细胞(BMSCs)与肺泡上皮细胞(MLE-12)进行非接触共培养,在共培养中加入γ-分泌酶抑制剂(DAPT)观察其对BMSCs分化过程产生的影响,明确γ-分泌酶抑制剂(DAPT)阻断Notch信号通路对BMSCs诱导分化肺泡上皮细胞过程中的影响。方法:取4周左右的小鼠胫骨及股骨,采用全骨髓贴壁细胞法进行分离、培养骨髓间充质干细胞,取第3代的骨髓充质干细胞采用流式细胞学技术进行鉴定。将纯化后的第4代骨髓间充质干细胞与肺泡上皮细胞在Transwell体系下进行非接触共培养,并在共培养的基础上加入γ-分泌酶抑制剂DAPT。本实验分为3个组:空白对照组即为低糖培养基单独培养骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞与肺上皮细胞共培养诱导分化组、加入DAPT20ng/ml干预骨髓间充质干细胞与肺上皮细胞共培养诱导分化组。处理后用光镜观察共培养后BMCSs的形态结构变化,并分别在共培养的第10天提取蛋白及RNA,用Western和RT-q PCR检测Notch信号通路相关基因Notch1、HES1,Ⅱ型肺泡上皮细胞特异性表面活性蛋白(surfactant protein C,SPC)、Ι型肺泡上皮细胞标志水通道蛋白(aquaporin5,AQP5)的表达含量以此评估γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号通路对BMSCs向肺泡上皮细胞分化的作用。结果:1.分离后BMSCs在光镜下可观察到其形态为短梭形,经流式细胞术鉴定CD29、CD44表达阳性,CD34、CD45表达阴性,表明已成功提取到BMSCs.2.在光镜下观察共培养诱导分化的BMSCs由梭形逐渐变为似铺路石样上皮细胞形态。3.Notch信号通路在骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞分化时被激活,和空白对照组相比,Notch1蛋白表达和HES1m RNA表达升高(p0.05),差异有统计学意义。在BMSCs与MLE-12进行共培养的基础上加入抑制剂DAPT浓度为20ng/ml后,和共培养组相比,Notch1蛋白和HES1m RNA的表达减少(p0.05),差异有统计学意义,表明在共培养诱导分化的过程中γ-分泌酶抑制剂DAPT能够阻断Notch信号通路发挥效应。4.在共培养组、DAPT共培养组中将细胞培养10天后,经Western和RT-q PCR可检测到SPC、AQP5蛋白和m RNA。和空白对照组相比,共培养组和DAPT共培养组中SPC、AQP5蛋白及其m RNA的表达升高(p0.05),差异有统计学意义。DAPT共培养组与共培养组相比,SPC、AQP5蛋白及其m RNA的表达减少(p0.05),差异有统计学意义。结论:1.骨髓间充质干细胞在MLE-12诱导下可以定向分化为肺泡上皮细胞2.BMSCs在MLE-12诱导定向分化肺泡上皮细胞的过程中Notch信号通路被激活3.γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路在BMSCs诱导分化肺泡上皮细胞的过程中可能起抑制作用
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.9

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本文编号：1191029