自噬在LPS诱导的肺泡上皮细胞死亡中的作用及机制研究

发布时间：2017-11-20 14:08

  本文关键词：自噬在LPS诱导的肺泡上皮细胞死亡中的作用及机制研究

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【摘要】：1.背景与目的肺泡上皮细胞是急性肺损伤(acute lung injury,ALI)时受损的重要靶细胞,肺泡上皮细胞死亡是急性肺损伤的显著特征。肺泡上皮细胞损伤在ALI的发病中具有重要作用,也是评估预后的重要指标。内毒素是导致急性肺损伤的重要因素,其主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在ALI中起重要作用,目前认为过激的LPS-钟形受体4(toll like receptor 4,TLR4)应答所致的炎症反应失控是导致弥漫性肺泡损伤的重要原因,然而糖皮质激素等抗炎药物疗效有限,未能有效降低其病死率,使用促炎因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)受体拮抗剂患者亦未获益,因此对LPS导致肺泡上皮细胞损伤的作用及机制进行深入研究,可望为ARDS的防治提供新的靶点和思路。自噬对细胞有着两方面的作用,既可以作为一种促细胞生存的保护机制,又有促细胞死亡的作用,自噬的过度激活/抑制及功能失调在许多疾病中都起着重要的作用。目前一致认为:自噬促进细胞存活还是死亡取决于特异性刺激、环境条件及细胞类型。目前已证实,LPS刺激能使人肺泡上皮细胞株A549细胞存活率下降,既往对其死亡机制的研究主要集中在依赖于Caspase的凋亡,但自噬在LPS诱导的细胞死亡中是促进了细胞的存活还是诱导了细胞死亡,目前还尚不明确。我们的预实验发现:LPS能使人肺泡上皮细胞株A549细胞自噬水平增加,然而,增高的自噬是细胞受到LPS刺激时的保护性反应还是导致细胞死亡的原因尚不明确,且其作用机制尚需进一步研究。细胞自噬在生物体内受严格而精细的调控,越来越多的研究表明内质网应激及其触发的未折叠蛋白反应参与诱导激活细胞自噬。双链RNA依赖性蛋白激酶样内质网激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase,PERK),内质网跨膜蛋白激酶(inositol-requiring enzvme-1,IRE-1)及活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)是未折叠蛋白反应三条信号通路的重要感受器分子。研究显示,内质网应激触发的未折叠蛋白反应在决定细胞死亡或生存起重要作用。然而,LPS诱导的A549细胞自噬是否与内质网应激及未折叠蛋白反应有关尚不清楚。本研究:(1)应用RNA干扰技术或工具药物抑制/增强人肺泡上皮细胞株A549细胞自噬,明确自噬在LPS诱导的肺泡上皮细胞死亡过程中的作用;(2)复制LPS所致ali小鼠模型,观察干预自噬对肺泡上皮屏障功能的影响,从整体水平验证肺泡上皮自噬与ali肺泡上皮屏障功能障碍的关系;(3)应用rna干扰技术抑制a549细胞中由lps引发的内质网应激继之活化的未折叠蛋白反应信号通路中的关键蛋白,检测自噬活化标志蛋白表达及细胞存活的变化,进一步探讨lps诱导肺泡上皮细胞自噬的机制;本研究将进一步阐明自噬对肺泡上皮细胞死亡的调控作用及机制,初步揭示肺泡上皮细胞自噬在lps所致ali发病中的作用,为ali的临床治疗提供部分理论依据及实验基础。2.研究方法(1)自噬在lps诱导的人肺泡上皮细胞株a549细胞死亡中的作用①lps刺激a549细胞模型,通过免疫印迹检测自噬标志物微管相关蛋白轻链3b(microtubule-associatedprotein1lightchain3b,lc3b)、beclin-1、自噬相关基因(autophagyrelatedgenes,atg)5及降解底物蛋白p62的表达变化;电镜观察细胞超微结构改变;a549细胞转染增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,egfp)-lc3质粒后予lps刺激,激光共聚焦显微镜检测转染egfp-lc3融合蛋白的集聚变化;使用lps抑制剂多粘菌素b进一步确定增加的自噬是否有赖于lps的特异性刺激;②cck-8实验检测不同浓度的lps对a549细胞的毒性作用,并取最低有毒剂量处理细胞后,观察细胞坏死及凋亡变化;凋亡抑制剂预处理a549细胞后予最低有毒剂量lps刺激,观察细胞存活率,进一步验证凋亡是否参与lps诱导的肺泡上皮细胞死亡的作用;③自噬抑制剂或增强剂预处理a549细胞后予lps刺激,观察细胞存活率,研究自噬对lps诱导的肺泡上皮细胞死亡的作用;④使用特异性小干扰rna(shortinterferingrna,sirna)抑制肺泡上皮细胞自噬关键蛋白beclin-1或atg5的表达后,再予lps刺激,观察抑制自噬对细胞存活的影响,用遗传学技术进一步验证自噬在lps诱导的肺泡上皮细胞死亡中的作用。(2)自噬抑制剂对lps诱导的ali小鼠肺泡上皮屏障功能障碍的保护作用①建立lps诱导的ali小鼠模型,免疫印迹检测肺组织自噬蛋白的表达变化,免疫荧光观察肺组织自噬蛋白的表达变化及细胞定位,透射电子显微镜检测肺泡上皮细胞自噬超微结构;②使用自噬药物抑制剂后,观察肺损伤评分、肺湿干重比、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,balf)总蛋白的变化,用工具药从整体上验证干预自噬是否对lps诱导的ali小鼠肺泡上皮屏障功能障碍起保护作用;(3)lps诱导的人肺泡上皮细胞株a549细胞自噬性死亡的机制①lps刺激a549细胞后,观察内质网应激主要标志性分子葡萄糖调节蛋白(glucose-regulatedprotein,grp)78、grp94的表达变化;内质网应激抑制剂作用下观察自噬标志物lc3b-Ⅱ的变化,研究内质网应激对自噬的影响;②lps刺激a549细胞后,观察未折叠蛋白反应的三条信号通路perk、ire1及atf6的关键蛋白表达变化;用sirna干扰技术分别抑制相关信号通路中的关键蛋白,检测自噬活化标志蛋白表达及细胞存活变化,从细胞水平确定lps激活肺泡细胞自噬性死亡的相关信号通路。3.结果(1)lps处理a549细胞后,自噬蛋白lc3b-Ⅱ的转化及beclin-1、atg5的表达呈时间及剂量依赖性增加,自噬降解底物蛋白p62水平则呈时间及剂量依赖性减少;lps抑制剂多粘菌素b预处理能抑制lps诱导的lc3b-Ⅱ增加;与对照组比较,lps处理组egfp-lc3点状聚集数显著增加,差异有统计学意义(p0.01);电镜观察lps处理组可见自噬体;(2)与0?g/ml比较,小于50μg/ml的lps处理组细胞存活率差异无统计学意义(p0.05),50,100,150μg/ml的lps处理16h后,细胞存活率下降,差异有统计学意义(p0.05,p0.01,p0.01),且细胞的存活率随着lps浓度增加而减少,表现为剂量依赖效应。多粘菌素b预处理能抑制lps所致的细胞存活率下降(p0.05);(3)50μg/ml的lps刺激a549细胞16小时,细胞凋亡数及乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,ldh)泄漏率(细胞坏死标志物)与对照组比较,差异无统计学意义(p0.05);(4)自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-ma)预处理能降低lps诱导的lc3b-Ⅱ增加及细胞存活率的下降(p0.05);自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,rapa)预处理则增加了lps诱导的lc3b-Ⅱ增加及细胞存活率的下降(p0.05)。与对照组比较,凋亡抑制剂预处理组细胞存活率增加差异无统计学意义p0.05);(5)特异性sirna能有效抑制beclin-1及atg5的表达和lps诱导的lc3b-Ⅱ的转化、egfp-lc3点状聚集数的增加及细胞存活率的下降(p0.05);(6)15mg/kg的lps腹腔注射小鼠16小时后,肺损伤评分,balf中促炎因子il-1β、tnf-α、巨噬细胞炎性蛋白-2(macrophageinflammatoryprotein-2,mip-2)水平、细胞总数及中性粒细胞比例、总蛋白,以及肺湿干重比较对照组增高,差异有统计学意义(p0.05);(7)Western blot结果显示,与生理盐水对照组比较,LPS处理8h后小鼠肺组织中LC3B-Ⅱ的表达增加,16 h后增加明显;免疫荧光检测显示LPS处理16 h后小鼠肺组织中LC3B的表达增加,且LC3B能够和肺表面活性物质相关蛋白(pulmonary surfactant associated protein C,SPC)进行共标,透射电镜结果显示,LPS处理16 h后小鼠肺肺泡上皮内有较多自噬小体,而生理盐水对照组细胞中未观察到自噬小体的存在;(8)与对照组比较,3-MA或氯喹(chloroquine,CLQ)预处理组小鼠BALF中的总蛋白、肺湿干重比及肺损伤评分明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。3-MA预处理组中,BALF中的促炎因子无变化,而CLQ预处理则明显减少了BALF中的促炎因子IL-1β,TNF-α,MIP-2水平(P0.01);(9)LPS处理A549细胞后,GRP78、GRP94的蛋白表达呈时间及剂量依赖性增加;内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)能抑制LPS诱导的LC3B-Ⅱ的转化;(10)LPS处理A549细胞后,磷酸化的PERK(phosphorylated PERK,p-PERK)及其下游信号分子磷酸化的真核启动因2(phosphorylated eukaryotic initiation factor-2,p-e IF2α)、ATF4、生长停滞和DNA损伤诱导蛋白34(growth arrest DNA damage gene 34,GADD34)的表达呈时间及剂量依赖性增加,剪接型X盒结合蛋白1(splicing of X box binding protein 1,sXBP1),ATF6的表达无变化;(11)特异性siRNA能有效抑制PERK及ATF4的表达和LPS诱导的LC3B-Ⅱ的转化、EGFP-LC3点状聚集数的增加及细胞存活率的下降(P0.05)。4.结论(1)自噬在LPS诱导的肺泡上皮细胞死亡过程中起促进细胞死亡的作用,最小细胞毒剂量的LPS可诱导肺泡上皮细胞自噬性死亡;(2)LPS诱导的ALI小鼠肺泡上皮细胞自噬增强,抑制自噬能改善小鼠肺泡屏障功能的障碍;(3)内质网应激触发的未折叠蛋白反应PERK-eIF2α-ATF4-GADD34信号通路参与了LPS诱导的A549细胞自噬性死亡。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563

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