冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）在慢性组织缺氧致冷敏感的分子机制研究

发布时间：2017-11-26 18:16

  本文关键词：冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）在慢性组织缺氧致冷敏感的分子机制研究

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【摘要】：目的:明确慢性阻塞性疾病患者和正常人群支气管上皮,冷应激状态下慢性组织缺氧大鼠和正常大鼠支气管上皮以及正常人支气管上皮细胞(NHBE)株中CIRP的定位和表达情况。构建慢性组织缺氧的冷敏感在体大鼠和离体细胞模型,探讨CIRP在慢性组织缺氧的慢阻肺患者冷敏感及其诱导的炎性因子浸润的分子机制。方法:(1)目标人群、冷应激状态下慢性组织缺氧大鼠、正常大鼠支气管上皮以及正常人支气管上皮NHBE细胞株中CIRP的定位和表达情况构建慢性组织缺氧及冷敏感大鼠和低氧、低温细胞模型,采用免疫组织化学法检测目标人群、冷应激状态下慢性组织缺氧大鼠和正常大鼠支气管上皮中CIRP的分布特征,激光共聚焦显微镜观察冷刺激前后CIRP蛋白在NHBE细胞内定位及分布情况。再通过Real time-PCR和Western blotting法分别检测目标人群、冷应激状态下慢性组织缺氧大鼠和正常大鼠支气管粘膜上皮以及NHBE细胞株中CIRP的基因和蛋白表达水平。(2)CIRP在低温、低氧环境下的促炎分泌效应构建cirp-shrna质粒并转染细胞株,realtime-pcr和westernblotting法检测cirp特异性shrna的沉默效率。给予最适冷刺激温度和时长刺激nhbe细胞,细胞免疫荧光检测冷刺激前后cirp的胞内定位及表达情况,realtime-pcr、westernblotting及elisa法分别观察各组细胞内和细胞培养液中的cirp和炎性因子表达含量,明确cirp在低温低氧情况下的促炎效应。(3)应激颗粒参与cirp介导的促炎效应构建eif2α-sirna和cirp-shrna共转染细胞株,realtime-pcr和westernblotting法检测eif2α特异性sirna的沉默效率。给予最适冷刺激温度和时长刺激nhbe细胞,细胞免疫荧光观察应激颗粒(eif2α标记)的胞内情况,realtime-pcr、westernblotting及elisa法分别检测转染前后各种细胞中cirp、炎性因子基因和蛋白的表达水平,明确应激颗粒参与cirp介导的促炎效应。(4)cirp对炎症因子的mrna3′utr的转录后调控机制构建双重荧光素酶基因真核表达质粒(pgl3-tnf-α3′utr、pgl4.75-il-83′utr和pgl3-il-63′utr)及psvrenillaluciferase,用lipo2000转染质粒于稳转cirp-shrna的nhbe细胞株,再给予最适冷刺激,采用双重荧光素酶基因检测技术检测刺激前后荧光素酶的活性;制备体外生物素(biotin)标记的炎症因子(tnf-α、il-6、il-8)的mrna3′utr探针,采用rnapull-down技术检测cirp与炎症因子mrna3′utr的特异性结合;构建cirp-shrna转染细胞株,给予最适冷刺激后加入actinomycind终止转录,通过real-timepcr检测不同时间点炎性因子mrna的表达量,用opticon2.02软件分析不同时段mrna的表达量并计算出其半衰期(t1/2),从而分析mrna的稳定性,明确cirp介导慢性缺氧状态下冷应激诱导的炎性因子mrna的稳定性调控作用。结果:(1)目标人群、冷应激状态下慢性组织缺氧大鼠、正常大鼠支气管上皮以及正常人支气管上皮nhbe细胞株中cirp的定位和表达情况慢性阻塞性肺疾病患者、正常人群支气管上皮细胞、冷应激状态下慢性组织缺氧大鼠支气管及健康大鼠支气管上皮细胞均有cirp表达,且慢性阻塞性肺疾病患者中cirp表达明显高于正常健康人群,冷应激状态下慢性组织缺氧大鼠中cirp表达明显高于健康大鼠,主要定位于细胞胞浆中。当给予冷刺激后,细胞中cirp呈高表达状态,主要富集于细胞胞浆中。(2)cirp在低温、低氧环境下的促炎分泌效应成功构建cirp-shrna转染细胞株,cirp-shrna具备较理想的沉默效率。在cirp-shrna转染细胞中,当给予冷刺激后,cirp-shrna转染细胞内几乎无cirp表达。可见cirp-shrna可显著阻断冷刺激诱导的cirp表达和炎症反应。(3)应激颗粒参与cirp介导的促炎效应eif2α-sirna可明显抑制慢性缺氧状态下冷应激诱导的炎症反应,细胞内炎性因子(tnf-α、il-6、il-8)mrna和蛋白表达水平明显降低。单独转染eif2α-sirna或cirp-shrna或共转染组,细胞免疫荧光发现细胞内应激颗粒(蓝色)的数量明显减少。在基因和蛋白表达水平上进一步观察,上述各种细胞胞浆内其表达量均明显降低,但eif2α-sirna单独转染组中,cirpmrna和蛋白表达量无明显变化。(4)cirp对炎症因子mrna的转录后调控机制分别构建双重荧光素酶基因真核表达质粒(pgl3-tnf-α3′utr、pgl4.75-il-83′utr和pgl3-il-63′utr),转染荧光素酶基因真核表达质粒及psvrenillaluciferase于nhbe细胞株或稳转cirp-shrna的nhbe细胞株,每组给予相同冷刺激和作用时长处理后,荧光素酶活性检测发现转染cirp-shrna后荧光素酶活性明显降低;转染炎症因子的mrna3′utr基因真核表达质粒转染的细胞株给予冷刺激后,用生物素标记的炎症因子的mrna3′utr探针进行rnapull-down,其结果显示冷刺激组中特异性结合的cirp蛋白较未给予冷刺激组明显增高。通过检测不同时间点(1.5h,3h和3h)上三种炎性因子的mrna的表达水平,我们发现低氧低温刺激后各时间点上的mrna的表达水平均无明显差异,其半衰期明显延长,而在转染cirp-shrna组中,炎症因子的mrna在3h和6h的表达量具有明显差异,6h时mrna的表达量明显降低,其半衰期明显缩短。结论:(1)慢性阻塞性肺疾病患者和冷应激状态下慢性组织缺氧大鼠支气管上皮中cirp呈高表达状态,并富集于靠管腔细胞的胞浆中;(2)低温低氧可诱导NHBE细胞CIRP的高表达,并促使其由聚集于胞浆内;(3)CIRP mRNA和蛋白表达呈现出时间依赖性和部分低温赖性增加;(4)CIRP介导了低温低氧诱导的炎症反应;(5)冷刺激可诱导CIRP聚集于细胞的胞浆中,可向胞质内应激颗粒移动并聚集。并且,CIRP还可促进应激颗粒的形成,二者共同参与了低氧低温诱导的炎症反应;(6)在冷应激状态下,CIRP具有增加炎症因子的mRNA稳定性,从而提高mRNA的翻译效率和速率,扩大了冷应激条件下的炎性效应。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.9

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