Nogo-B在LPS诱导的巨噬细胞免疫应答中的作用及其机制初探

发布时间：2017-11-30 15:34

  本文关键词：Nogo-B在LPS诱导的巨噬细胞免疫应答中的作用及其机制初探

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【摘要】：背景:急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是呼吸系统常见的危重症之一,微生物感染、外伤、毒气、污染物、自身抗体、胃酸、栓塞和自由脂肪酸等多种生物、物理和化学因素均可导致ALI。尽管在过去几十年中人们对ALI的认识不断加深,在治疗上也取得了重大进步,但ALI的死亡率(约27%到45%不等)仍居高不下,且ALI的发生、发展机制也尚无定论。鉴于当前临床上ALI患者面临着高死亡率、低治愈率和差的生活质量的现实,探明ALI的病理生理机制从而找到有效的治疗措施迫在眉睫。肺泡巨噬细胞(Alveolar Macrophages,AM)作为肺部主要的固有免疫细胞,在ALI的发生、发展中起着关键作用。众所周知,巨噬细胞是免疫系统的重要成分之一,参与了各种炎症的固有免疫应答和适应性免疫应答,此外,在损伤修复、组织重构及纤维化等过程中也起着重要作用。Nogo-B是网状蛋白家族(reticulon super-family proteins,RTNs)中的成员,因参与了多种细胞生物学过程,近来成为了国内外的研究热点,研究发现Nogo-B可以调节巨噬细胞的募集,调控巨噬细胞迁移、粘附、吞噬、炎症因子分泌及杀伤作用等生物学功能,同时内源性的Nogo-B还可能与巨噬细胞的活化和转运有关。然而,在ALI状态下,Nogo-B是如何调控巨噬细胞的免疫应答目前尚不明确。我们在前期的研究中观察到ALI小鼠的肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)细胞中,肺气道、血管及肺泡上皮组织中Nogo-B的表达水平均较正常小鼠降低,以BALF细胞降低最为显著,而BALF中的细胞成分主要为AM。因此,我们推测Nogo-B对AM的功能发挥起着至关重要的作用。为了证实上述推论并初步阐明其分子机制,本研究选用小鼠巨噬细胞株RAW264.7为研究对象,在LPS刺激下研究Nogo-B对巨噬细胞分泌、迁移、抗原提呈等免疫应答过程的影响并初步探讨其机制。方法:一、选择小鼠巨噬细胞株RAW264.7作为本实验的研究对象,加入胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基在37℃,5%CO_2浓度的培养箱中进行培养。用Western blot检测巨噬细胞RAW264.7内不同LPS浓度下以及LPS刺激后不同时间段内Nogo-B表达水平。二、分别采用腺病毒转染和siRNA干扰的方法上调和下调巨噬细胞中Nogo-B的表达水平,选择LPS刺激的最佳浓度和时长,采用ELISA方法检测巨噬细胞炎症因子的释放情况,Transwell实验观察巨噬细胞的迁移能力的变化,流式细胞术检测巨噬细胞表面MHC Ⅰ/Ⅱ进而评估其抗原提呈能力,以及Western Blot方法检测MSR1进而判断巨噬细胞的吞噬能力。三、探索LPS刺激下Nogo-B影响巨噬细胞功能可能的机制。采用流式细胞术检测不同Nogo-B表达水平的巨噬细胞表面TLR4的表达情况,Western Blot方法检测不同Nogo-B表达水平的巨噬细胞中MAPK通路相关分子ERK、JNK和P38的磷酸化水平,以初步阐明Nogo-B通过TLR4-MAPK通路调控巨噬细胞的生物学功能。结果:一、LPS诱导巨噬细胞表达Nogo-B的变化规律巨噬细胞Nogo-B蛋白随着LPS刺激浓度的增高而降低,即Nogo-B蛋白的表达水平呈现LPS浓度依赖性降低,在LPS浓度为1μg/ml时降至最低。当LPS刺激浓度为1μg/ml时,巨噬细胞中Nogo-B的表达水平随着LPS刺激时间的延长而逐渐下降,在刺激后的24h其表达量降至最低并一直持续到48h。二、LPS刺激后,调控Nogo-B表达对巨噬细胞免疫应答的影响(一)、LPS刺激后,过表达Nogo-B的RAW264.7炎症因子TNF-α,MCP-1和TGF-β的分泌均较对照组显著增加;而低表达Nogo-B的RAW264.7炎症因子TNF-α,IL-1β,MCP-1和TGF-β的分泌水平显著受到抑制。(二)、LPS刺激24h后,过表达Nogo-B的RAW264.7迁移能力较对照组升高1.8倍;而低表达Nogo-B的RAW264.7则迁移能力较对照组减低1.5倍。(三)、LPS刺激后MHC Ⅱ在过表达Nogo-B的RAW264.7中表达量随着LPS刺激时间的推移显著增加,而在低表达Nogo-B的RAW264.7中,MHCⅡ的表达量显著低于对照组。调控Nogo-B的表达水平,MHC Ⅰ的表达未见明显变化。(四)、LPS刺激后24h,MSR1在过表达Nogo-B的RAW264.7中其表达量明显升高,而在低表达Nogo-B的RAW264.7中显著减少。三、Nogo-B影响巨噬细胞表面TLR4的表达并调节MAPK通路的活化LPS刺激后过表达Nogo-B的RAW264.7表面TLR4的平均荧光强度以及ERK,JNK和p38的磷酸化水平显著升高,而低表达Nogo-B的RAW264.7其表达量显著下降。结论:一、Nogo-B在巨噬细胞中的表达水平受LPS刺激的影响,LPS浓度为1μg/ml刺激时间为24h时,RAW264.7中Nogo-B的表达下降最为显著。二、Nogo-B的表达水平与巨噬细胞炎症因子的释放、迁移能力、抗原提呈能力和吞噬能力成正相关。三、Nogo-B可能通过调节细胞表面TLR4的表达和激活MAPK通路影响巨噬细胞的免疫应答。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563

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本文编号：1239830