Nogo-B调控上皮间质转化在急性肺损伤后期肺间质纤维化中的作用

发布时间：2017-12-14 17:19

  本文关键词：Nogo-B调控上皮间质转化在急性肺损伤后期肺间质纤维化中的作用

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【摘要】：研究背景:急性肺损伤(Acute lung injury,ALI),即急性呼吸窘迫综合症(Acute respiratory distress syndrome,ARDS),是一种常见的呼吸系统危重症。尽管采取了综合的治疗手段,其死亡率仍居高不下。即便是部分安全渡过急性期的病人,在其ARDS后期纤维增生阶段,肺部发生成纤维细胞聚集、胶原沉积等纤维增生反应,如无法有效逆转,会导致肺间质纤维化,使这些患者出现机械通气依赖、生活质量下降等问题。而肺的纤维增生主要有三种来源:肺上皮细胞经过上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)形成成纤维细胞,循环成纤维细胞募集入肺,以及肺固有成纤维细胞活化增殖。网状蛋白4(Reticulon4B,RTN4B),也称轴突生长抑制剂-B(inhibitor of neurite outgrowth-B,Nogo-b),是网状蛋白家族的一员,主要定位在内质网上。新近研究表明,它与炎症发生及损伤修复均密切相关,在肝纤维化的发生、宫颈癌细胞He La细胞EMT反应中都起到重要作用。本课题组前期研究证实,Nogo-B在肺泡上皮细胞表达,且在ALI发生发展的过程中发挥了重要作用。那么,Nogo-B在ALI后期纤维增生阶段扮演怎样的角色呢?本课题旨在明确Nogo-B在LPS诱导的小鼠ALI模型后期肺间质纤维化的作用,以期为明确该疾病的发生发展机制乃至为治疗策略的制定有所帮助。研究方法:一、体内实验(一)实验对象:野生型C57BL/6小鼠及Nogo-B敲除小鼠,6-8周,雄性。(二)造模及分组:通过脂多糖(lipopolusaccharide,LPS)气管滴入构建小鼠的ALI模型,以等量磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)滴入构造正常对照模型。随机分组,收集正常对照组、造模第一天组、造模第四天组、造模第七天组及造模第十天组小鼠的肺组织标本。(三)检测方法:通过病理切片、Masson染色、免疫组化、实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitiative PCR,rt-q PCR)、蛋白印迹试验(Western Blot,WB)等检测Nogo-B在ARDS中的表达变化,明确Nogo-B是否参与ARDS后期的纤维增生的过程。同时,检测纤维增生主要诱导因子转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGFβ)以及标志分子上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin,α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)表达变化,明确ALI模型后期是否发生肺间质纤维化,以及Nogo-B的敲除是否会对纤维增生反应有所影响。(一)研究对象:小鼠肺泡上皮细胞株(MLE-12)(二)造模及分组:选用小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)干扰建立Nogo-B低表达MLE组,设立空白对照组及阴性对照组(Negtive si RNA),并通过TGFβ1诱导MLE细胞EMT反应,收集细胞蛋白及RNA。(三)检测方法:通过rt-q PCR、WB对比Nogo-B低表达MLE组与对照组在TGFβ1诱导下Nogo-B表达变化,及EMT反应中上皮及间质分子标记表达变化,进一步明确Nogo-B在其中的作用。二、体外实验:研究结果:一、小鼠急性肺损伤模型中Nogo-B表达变化及其与后期肺间质纤维化形成的关联性研究LPS诱导小鼠ALI模型的病理切片显示,造模第一天小鼠肺部炎症较重,第四天炎症反应逐渐减轻而纤维化加重,至第七天和第十天,炎症基本消退而肺纤维化明显。而正常对照组小鼠既有少量Nogo-B表达,造模第一天明显下降,第四天后逐渐增高,高表达持续至第七天,与纤维增生反应发生的时间趋势一致。同时,在造模第一天,纤维增生反应主要诱导因子TGFβ即释放增加,上皮表面标记E-cadherin表达明显下降,而随着时间推进,上皮细胞位置逐渐出现间质细胞表面分子α-SMA及Vimentin表达。第七及第十天TGFβ持续表达较高,E-cadherin表达明显下降而α-SMA及Vimentin表达增高。结果提示Nogo-B与肺间质纤维化的发生相关。二、调控Nogo-B表达对小鼠急性肺损伤模型炎症反应及后期肺间质纤维化的影响LPS诱导的Nogo-B敲除小鼠与野生型小鼠相比,正常对照组肺组织切片表现基本一致,而造模第一天敲除鼠炎症程度明显较野生型重,至第七天仍有部分炎症反应而野生型小鼠炎症基本吸收,而第十天与正常组小鼠相比,纤维化程度较正常小鼠轻。同时,在ALI发生发展过程中,敲除鼠与野生型小鼠相比,TGFβ表达变化基本一致,而第七天及第十天α-SMA及Vimentin表达较低,提示Nogo-B敲除小鼠虽然经历更重的炎症反应,但是后期纤维化反应减轻。三、调控Nogo-B表达对小鼠急性肺损伤模型后期肺间质纤维化影响的可能的机制探讨已有文献表明,在肺间质纤维化的过程中EMT反应在其中起到了重要作用。通过对MLE-12细胞进行si RNA干扰Nogo-B表达和TGFβ1诱导EMT反应,发现,TGFβ1诱导下Nogo-B表达明显升高,而进行Nogo-B干扰发现,干扰组上皮细胞上皮表面标记E-cadherin表达较未干扰组较高而间质细胞表面标记α-SMA及Vimentin表达较低,提示下调Nogo-B影响了TGFβ对细胞EMT的诱导。通过对主要信号通路分子进行检测发现,下调Nogo-B组Smad2磷酸化水平下降,说明Nogo-B能通过干扰TGFβ/Smad2通路影响MLE细胞的EMT反应。研究结论:一、在LPS诱导的小鼠ALI模型中,后期发生了肺间质纤维化,并且Nogo-B参与了LPS诱导小鼠ALI过程中的炎症发生及纤维增生反应。二、Nogo-B敲除鼠与野生型小鼠相比,前期炎症反应较重而后期纤维化较轻,进一步证实了Nogo-B的存在对LPS诱导小鼠ALI模型中的炎症及肺间质纤维化的发生发展有保护性作用。三、Nogo-B可以通过TGFβ/Smad通路影响TGFβ1诱导的MLE细胞株EMT反应过程,提示Nogo-B可能是通过影响EMT反应影响ALI小鼠后期肺间质纤维化的发生。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563

【参考文献】

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本文编号：1288714