野生型P53基因诱导肺上皮细胞凋亡在海水吸入型肺损伤中的作用机制研究

发布时间：2017-12-24 03:32

  本文关键词：野生型P53基因诱导肺上皮细胞凋亡在海水吸入型肺损伤中的作用机制研究　出处：《第四军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 海水 急性肺损伤 细胞凋亡 野生型p53 p38

【摘要】：研究背景： 海水淹溺是导致急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的常见病因。生活中，有很多因素可以导致ALI的发生，如异物误吸，传染性肺炎、毒物接触等等，这其中就包括淹溺，尤其是海水淹溺。淹溺诱发的肺损伤多是由于气道内被动吸入过多液体，破坏了肺泡结构，导致肺水清除功能和气体交换功能下降，最终发生肺水肿和通气\血流比例下调，出现进行性低氧血症和呼吸窘迫，严重者会进展成急性呼吸窘迫综合症（acute respiratory distress syndrome，ARDS），甚至死亡。近年来，关于海水淹溺性急性肺损伤的研究大量展开，但都是基于动物模型基础上的研究，关于其中的致伤机制也陆续被揭示。 凋亡是一种由基因控制的程序性细胞死亡过程。生理情况下的凋亡对于维持机体新陈代谢，促进内环境稳定有积极作用；病理情况下的凋亡尤其是过度凋亡，会导致死亡物质大量堆积，死亡物质的清除引起吞噬细胞的集聚，促使炎症介质大量释放，，加重肺损伤。最近，ALI中肺泡上皮细胞凋亡的研究被大量报道。我科前期的研究发现，在海水吸入型急性肺损伤(seawater inhalation induced acute lung injury，SWI-ALI）中，肺泡上皮细胞及内皮细胞的凋亡是增加的[1]。诱发细胞凋亡的因素有很多，调节通路更是多种多样。野生型p53（wild type p53，wtp53）是调节细胞凋亡的重要因子，SWI-ALI中，wtp53基因及其调节通路是否参与了海水诱导的细胞凋亡，及相关作用机制未曾揭示。 实验目的： 通过复制SWI-ALI大鼠模型，观察海水吸入后对肺组织上皮细胞凋亡的影响，同时观察野生型p53和其调节的凋亡相关基因及p38基因在海水作用时的表达，探讨在海水吸入型肺损伤发生后野生型p53诱导肺上皮细胞凋亡的作用机制，并进一步研究了海水触发野生型p53表达的机制。 实验方法： 实验一：40只SD大鼠随机分为空白对照组、海水1、3、6、12h组，每组8只。4个海水处理组大鼠气管内注入4ml/kg海水，分别作用1h、3h、6h和12h；对照组除不吸人海水外，其余处理同海水淹溺组。于各时间点上放血处死大鼠，行动脉血气分析，测肺湿/干重比（W/D)， HE染色观察肺组织病理形态改变，RT-PCR检测wtp53、Bax、Bcl-2及细胞色素c（cytochrome-c，Cyt-c）mRNA的表达，免疫组化法分析wtp53、p-p38和Bax表达变化，western blotting分析wtp53、p38和p-p38、p-p53、Bax、Bcl-2和Cyt-c及活化caspase-3的蛋白表达。 实验二：新传代的细胞常规培养4天后干预。除对照组外均在培养基中加入海水，海水干预浓度为40%（即1ml总体积中含0.4ml海水），孵育时间为3h；实验设对照组、海水组、海水+PFT-α组、海水+SB203580组、海水+DMSO组，在加入海水后，立即将20μM的PFT-α、SB203580及10μl的DMSO加入培养基中共同孵育。流式细胞仪检测各组细胞凋亡，Western blotting检测各组p-p38、p-p53和其相关下游目的蛋白的表达。 实验结果： 实验一：海水吸入后，血气结果显示大鼠出现了明显的低氧血症，HE结果示肺组织破坏严重，且海水作用时间越久，肺组织损伤越严重；海水吸入引起促凋亡基因wtp53、Bax及Cyt-c的mRNA表达增加（P0.05），抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA表达随海水吸入时间增加逐渐下降；同时发现，相应因子的蛋白表达与PCR的结果一致，我们还观察了海水吸入后p38的蛋白表达，结果显示，海水升高了p38的磷酸化水平，且与p-p53及其下游促凋亡因子的增加趋势一致。 实验二：流式细胞仪检测显示，海水处理明显引起A549细胞凋亡（P0.05vscontrol group），PFT-α和SB203580都可以抑制海水的这种促凋亡作用。海水单独作用和海水+DMSO共孵育引起的凋亡结果无明显不同，提示DMSO对海水作用无影响（P0.05）。蛋白表达结果显示，与海水组比较，PFT-α和SB203580分别降低了海水组中p-p53的水平，但仍高于对照组，且PFT-α的抑制作用更明显，这一点与细胞凋亡抑制结果一致；有趣的是，PFT-α只抑制了p-p53的表达，对p-p38无影响；SB203580在抑制p-p38表达的同时抑制了p-p53的表达；我们同时观察到Bax、Cyt-c及cleaved caspase-3的表达被PFT-α和SB203580抑制，Bcl-2的表达反而增加。 结论： 野生型p53及其下游目的基因通过内源性途径调节了SWI-ALI时肺泡上皮细胞的凋亡，P38MAPK作为p53的上游因子，通过磷酸化p53，部分地介导了海水吸入诱导的细胞凋亡调节。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 张奇;白晓东;付小兵;;p38MAPK信号通路研究进展[J];感染 炎症 修复;2005年02期

2 张新红,段蕴铀;部分液体通气对兔海水淹溺型肺水肿的气体交换和病理组织学的影响[J];解放军医学杂志;2004年08期

3 段蕴铀;张新红;;海水淹溺型急性肺损伤的研究现状[J];解放军医学杂志;2009年07期

4 王颖,张淑文,王宝恩;急性肺损伤与中性粒细胞凋亡[J];中华急诊医学杂志;2001年05期

5 齐玲;杨宁江;杨淑艳;赵东海;;bcl-2家族蛋白和信号传导通路[J];吉林医药学院学报;2011年01期

6 钱桂生;陈旭昕;;急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征发病机制的研究进展[J];内科理论与实践;2010年06期

7 管弦;王导新;;肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡在急性肺损伤中研究进展[J];临床肺科杂志;2012年06期

8 唐皓,马中富;p38 MAPK信号转导通路研究进展[J];热带医学杂志;2004年04期

9 周长喜;钱桂生;王关嵩;;海水淹溺机制研究进展[J];人民军医;2008年10期

10 王理想;伍火志;;肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡与肺损伤的研究进展[J];医学信息(上旬刊);2011年07期

本文编号：1326721