结缔组织生长因子与细胞外信号调节激酶及蛋白激酶C信号通路在香烟烟雾致肺血管重构调控机制中的作用及关系

发布时间：2018-01-26 23:36

本文关键词：香烟烟雾肺动脉平滑肌重塑结缔组织生长因子细胞外信号调节激酶1/2 蛋白激酶Cα 香烟烟雾提取物肺动脉平滑肌细胞增殖结缔组织生长因子细胞外信号调节激酶1/2 蛋白激酶Cα 香烟烟雾肺血管重构结缔组织生长　出处：《华中科技大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分结缔组织生长因子和细胞外信号调节激酶1/2、蛋白激酶Cα在香烟烟雾暴露大鼠肺血管重构中的表达变化目的：探讨在香烟烟雾暴露大鼠的肺血管中结缔组织生长因子、细胞外信号调节激酶1/2和蛋白激酶Cα表达的变化,以及它们与香烟烟雾暴露大鼠肺血管重构的关系。方法：将24只健康雄性Wistar大鼠(8周龄)随机平均分为4组：C组(对照组),S-1M组(香烟烟雾暴露1月组),S-3M组(香烟烟雾暴露3月组)和S-6M组(香烟烟雾暴露6月组)。取动脉血检测血氧分压(Pa02),HE和平滑肌细胞α肌动蛋白染色观察肺血管重构情况,Western blotting检测大鼠肺动脉平滑肌中CTGF、PKCα和p-ERK1/2蛋白的表达量。结果：各组大鼠动脉血氧分压之间比较无显著性差异,随着香烟烟雾暴露时间的延长,肺血管壁厚度和血管直径的比值(%WT)、完全肌化血管比例、CTGF和p-ERK1/2、 PKCα的蛋白表达水平随香烟烟雾暴露时间的延长而增加,各组间比较有显著性差异(p0.05)。CTGF和p-ERK1/2、PKCα的蛋白表达与大鼠的肺血管%WT和完全肌化血管比例呈正相关。结论：香烟烟雾暴露大鼠的肺血管重塑随暴露时间的延长而加重。同时,CTGF、活化的ERK1/2和PKCα在血管平滑肌中的表达随暴露时间的延长而显著增加,CTGF、 ERK1/2的活化和PKCα可能与香烟烟雾暴露致大鼠肺血管重构有关。第二部分结缔组织生长因子和细胞外信号调节激酶1/2、蛋白激酶Cα信号通路在香烟烟雾提取物致大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用及其之间的关系目的：探讨结缔组织生长因子在香烟烟雾提取物致大鼠肺动脉平滑肌增殖过程中是否通过蛋白激酶Ca、细胞外信号调节激酶1/2信号通路参与调节。方法：大鼠肺动脉平滑肌细胞进行原代培养,应用不同浓度(5、10、20、40、80μg/ml)的香烟烟雾提取物(CSE)刺激24小时,通过细胞计数评价细胞增殖情况。1、将细胞分成5组：正常对照组(CM组),CSE组,NsiRNA组,CSE+NsiRNA组,CSE+CTGFsiRNA组,各组细胞同步化后用相应的siRNA转染,再给予CSE刺激；2、将细胞分成4组：正常对照组(CM组),CSE组,PD98059组,CSE+PD98059组,各组细胞同步化后需要的应用PD98059预处理1小时,之后应用CSE刺激。采用细胞计数及BrdU掺入法检测细胞增殖情况,分别采用real-time PCR和Western blotting检测各组CTGF、ERK1/2和PKCa的mRNA及蛋白表达。结果：20μg/ml的CSE浓度对细胞的促增殖作用最强,在CSE (20μg/ml)刺激下,CTGF和PKCa的mRNA和蛋白表达水平均升高,大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖明显；CTGFsiRNA除了明显抑制CTGF的表达之外,PKCa的mRNA和蛋白表达和ERK1/2的活化也明显受到抑制,CSE诱导的肺动脉平滑肌细胞的增殖也受到抑制；PD98059可以抑制CSE刺激下ERK1/2的磷酸化及肺动脉平滑肌细胞的增殖,但是对CTGFmRNA和蛋白的表达没有显著影响。结论：结缔组织生长因子在香烟烟雾提取物刺激诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞异常增长的过程中,通过细胞外信号调节激酶1/2和蛋白激酶Ca信号通路参与调节。第三部分结缔组织生长因子和细胞外信号调节激酶1/2、蛋白激酶Cα信号通路在香烟烟雾致大鼠肺血管重构中的作用及关系目的：探讨结缔组织生长因子在香烟烟雾暴露致大鼠肺血管重构中是否通过蛋白激酶Cα、细胞外信号调节激酶1/2信号通路参与调节。方法：构建沉默大鼠CTGF表达的慢病毒,1、转染大鼠肺动脉平滑肌细胞,将细胞分成5组：正常对照组(CM组),CSE组,LV-NsiRNA组,CSE+LV-NsiRNA组,CSE+LV-CTGFsiRNA组,各组细胞同步化后用转染相应的siRNA慢病毒载体,再给予CSE刺激；2、通过气道给药的方式用慢病毒感染大鼠,将大鼠分成4组：正常对照组(controls组),烟雾暴露组(smoking组),烟雾暴露阴性病毒干预组(smoking+LV-NsiRNA组),烟雾暴露阳性病毒干预组(smoking+LV-CTGFsiRNA组),每组6只,各组大鼠根据不同情况进行烟雾暴露和/或病毒感染,烟雾暴露时间为6周,分别应用real-time PCR和Western blotting检测各组大鼠肺血管CTGF.ERK1/2和PKCa的mRNA及蛋白表达,通过HE染色和平滑肌细胞α肌动蛋白染色观察肺血管重构情况。结果：慢病毒成功转染大鼠肺动脉平滑肌细胞,沉默CTGF表达的阳性慢病毒可以使CSE (20μg/ml)刺激下高表达的CTGF明显受到抑制,大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖也显著受到抑制,慢病毒构建成功；各组大鼠在不同慢病毒感染和／或香烟烟雾暴露处理完成后处死,各组Pa02无显著差异,和对照组比较,香烟烟雾暴露组CTGF和PKCα、p-ERKl/2表达升高,和香烟烟雾暴露阴性病毒感染组比较,香烟烟雾暴露阳性病毒感染组CTGF表达下降,同时,PKCa和p-ERK1/2表达受到抑制,HE染色及平滑肌细胞a肌动蛋白染色观察血管重构情况较阴性病毒感染及香烟烟雾暴露大鼠组减轻。结论：结缔组织生长因子在香烟烟雾暴露大鼠的肺血管重构过程中,通过了细胞外信号调节激酶1/2和蛋白激酶Cα信号通路参与调节。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563

【参考文献】