树突状细胞对重组德国小蠊过敏原Bla g 7过敏应答及分子机制初步探讨

发布时间：2018-01-31 23:43

本文关键词： 蟑螂 Blag7 T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白4 树突状细胞 Th2向极化蟑螂 Blag7 Toll样受体4 树突状细胞丝裂原活化蛋白激酶　出处：《南京医科大学》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：基于哮喘病人和哮喘动物模型的研究已经广泛证明Th2细胞产生的细胞因子，譬如IL-4，IL-5和IL-13等，它们最终促进了包括气道炎症，粘液分泌过多，气道高反应性等在内的哮喘发生。然而，由过敏原诱导的促使初始T细胞分化为Th2类细胞的机制目前仍不明确。树突状细胞在受到外来抗原刺激成熟后，能够促使初始T细胞分化为Th1或者Th2类细胞。目前如何使得抗原特异性Th2类细胞极化，以及在过敏情况下保持Th2类细胞稳态依然未知。最新的研究表明树突状细胞能够表达T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白4,它能够与其配体T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白1相结合从而促进Th2细胞分化。这一研究为研究过敏性疾病的机制提供了一些帮助。 T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin mucindomain,TIM4)是一种表达与细胞表面的蛋白，它能够调节T细胞的效应。越来越多的数据证实多种T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白分子在Th1和Th2型免疫反应中起了重要的作用。其中，树突状细胞分泌的T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白4已经被证实能够促进CD4+T细胞分化为Th2细胞，而且在外源性抗原刺激后T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域蛋白的表达能够显著性升高，但是它在过敏性疾病中的角色作用目前仍不清楚。多种炎症细胞及免疫细胞参与的气道炎症是过敏性气道疾病的本质。广泛存在于免疫细胞表面的Toll样受体，无疑可以作为危险因素与机体反应间的重要媒介。Toll样受体是一种保守的模式识别受体家族中的一种，它能够识别特异性的微生物和允许宿主细胞区分自我和非自身分子。树突状细胞能够表达多种Toll样受体，譬如TLR2，TLR3等。细菌等外源性刺激能够激活TLR从而初始免疫反应，促进抗原适应免疫以应对外源性病原体。研究发现，TLRs广泛分布在参与哮喘发病的免疫细胞上，以来胚系基因编码的保守序列参与宿主防御、调节免疫和诱导耐受，与哮喘的发生发展密切相关。蟑螂在世界各地已经被证实可以促发过敏及其特异性哮喘。在我们日常生活中最常见的蟑螂种类则是德国小蠊和美洲大蠊。在过去的数十年了，多种德国小蠊过敏原（Bla g1, Bla g2, Bla g4, Bla g5, Bla g6, Bla g7and Bla g8)均已经被克隆表达。它们其中，Bla g7是一种肌球蛋白，是一种泛过敏原且能与血清IgE结合。Bla g7与另一种美洲大蠊的肌球蛋白Per a7有着非常相似的蛋白结构，而Per a7已经被报道能够促进肥大细胞系P815释放Th2类细胞因子IL-4与IL-13，因此我们预测Bla g7可能同样通过与TLR接触并发挥生物学效应，具有促进Th2类细胞因子释放的效应。树突状细胞是最强的抗原递呈细胞，它能够促进Th2类极化导致过敏的初始，在本次试验中我们主要研究Bla g7刺激树突状细胞以及它背后的机制。本次试验的目的主要是想证明Bla g7能够通过促进树突状细胞表达TIM4，继而促进CD4+T细胞分化为Th2细胞，以及Bla g7发挥免疫性效应是通过TLR方式。第一部分重组德国小蠊过敏原Bla g7通过促进树突状细胞表达TIM4蛋白诱导CD4+T细胞Th2向分化背景：蟑螂过敏原作为一个主要的户内过敏原，它能够促使过敏性鼻炎和哮喘发生，但是这背后的机制目前仍不明确。方法：采用重组Bla g7蛋白激发树突状细胞。使用定量PCR和Westernblotting方法检测激发后TIM4的mRNA以及蛋白水平的表达。将磁珠分离后CD4+阳性T细胞与Bla g7激发活化的树突状细胞共培养，采用流式细胞仪检测CD4+阳性T细胞的分化情况。采用特异性的抑制剂验证T细胞极化。结果：采用重组Bla g7激发后，树突状细胞表面共刺激分子CD80, CD86以及TIM4的表达升高。Bla g7能够诱导树突状细胞分泌IL-13，这一效应是通过TIM4，CD80和CD86依赖的方式。将Bla g7激发活化后的树突状细胞与CD4阳性T细胞共培养后，流式细胞仪检测T细胞胞内IL-4与IFN-γ表达情况，鉴定T细胞Th2向极化情况，同时上清液中的IL-13含量升高。抗TIM4，CD80和CD86抗体能够分别抑制Bla g7诱导的Th2向分化以及IL-13释放，提示Blag7诱导Th2向是通过TIM4，CD80和CD86依赖方式。结论：蟑螂过敏原Bla g7通过调节树突状细胞细胞因子释放，激发树突状细胞诱导T细胞Th2向极化，在过敏性疾病发生中起了重要的作用第二部分重组德国小蠊过敏原促进树突状细胞TLR4受体表达以及通过MAPK通路促进细胞因子释放背景：蟑螂过敏原能够促发过敏以及特异性哮喘。Toll样受体在固有免疫和适应性免疫中起了重要的作用。我们假设蟑螂过敏原Bla g7能够扮演TLR4受体激动剂，同时它能够与TLR4结合发挥生物学效应。本项研究主要想解释Blag7与TLR4在过敏中的相互作用以及背后机制。方法：采用纯化后不同浓度Bla g7激发树突状细胞，使用Western-blotting和流式细胞术检测树突状细胞表面分子CD80，CD86，HLA-DR和TLR4的表达。采用Western-blotting检测TLR4的蛋白表达情况。T细胞与Bla g7活化的树突状细胞共培养，采用CCK-8法检测T细胞的增殖情况。采用Western-blotting法检测TLR下游MAPK信号通路，采用相应抑制剂来反向验证MAPK通路。结果：以不同浓度Bla g7激发来自于健康人群和过敏人群的树突状细胞，，均能够显著增加HLA-DR和共刺激分子的表达。Bla g7活化的树突状细胞与T细胞共培养后能够显著促进T细胞增殖。Bla g7激发后，树突状细胞TLR4的以浓度依赖方式表达升高，抗Bla g7单克隆抗体可以拮抗这一效应。采用免疫共沉淀技术证明Bla g7能够结合细胞膜表面TLR4，进而活化MAPK和NF-κB通路。Bla g7能够促进细胞因子IL-4，IL-5以及IL-13的释放，其中来自于过敏人群的树突状细胞分泌能力强于正常人群。结论：TLR4是树突状细胞处理抗原Bla g7的重要媒介，Bla g7通过TLR4方式诱导细胞因子释放发挥生物学效应。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R562.25

【参考文献】