机械通气相关性肺损伤中NLRP3蛋白与线粒体功能的变化

发布时间：2018-02-14 13:01

  本文关键词： 机械通气相关性肺损伤 NLRP3 炎症 线粒体　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的机械相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)是一种在应用呼吸机过程中由于机械张力的各种因素作用于肺组织引起的以肺泡结构破坏、肺泡腔充血出血为病理特征的综合征,临床多表现为肺水肿及呼吸功能障碍。非生理性牵张除了通过机械剪切力破坏血气功能屏障,使细胞膜通透性增加之外,还能激活体内的炎症信号通路,导致白细胞和各种促炎因子在损伤部位聚集,导致肺部产生炎症应答,启动和加重肺组织损伤。在机体非特异性免疫系统中NLRP3炎性蛋白及炎性体也发挥着重要功能,其中NLRP3蛋白能够通过Toll样受体4(Toll Like Receptor 4,TLR4)转导入细胞中转录信号发生转录翻译,生成增加并使炎性体聚合,最终通过蛋白水解作用将无活性的炎性因子前体pro-IL-1β转变为成熟促炎因子IL-1β并释放至细胞外,引起机体的炎症损伤,在NLRP3蛋白活化过程中线粒体来源的活性氧族(Reactive Oxygen Species,ROS)起到了扳机作用,线粒体功能受损会导致线粒体膜电位(Mitochondria Membrane Potential,MMP)水平降低,发生ATP生成障碍、ROS异常生成增加等一系列后果,这些后果均会引起并加重体内炎症反应和氧化应激。因此,本研究通过体内试验和体外试验来研究NLRP3蛋白与线粒体功能在VILI发生发展过程中的变化。研究方法体内试验:SPF级C57BL/6小鼠30只,8-10周龄,体重20-25g,雌雄各半,随机分配成3组(n=10):对照组(Conrol,C组),机械通气组(Mechanical Ventilation,MV 组),机械通气+TLR4 阻断剂组(Mechanical Ventilation+TAK-242,MV+T组)。对C组小鼠做气管切开后不进行气管插管,自由通气;MV组、MV+T组行机械通气,RR=70次/min,VT=15ml/kg,I:E)=1:2,吸入氧浓度为21%,通气时间为4h。MV+T组在麻醉前用TLR4阻断剂TAK-242(3mg/kg)预处理1h。机械通气结束后,剪下右上肺放入EP管中,尽快使用液氮将其冷冻备用,后续蛋白免疫印迹法测NLRP3蛋白及NFκB-P65和磷酸化的NFκB-P65(NFκB-pP65);右肺下叶在4%多聚甲醛中固定48h后,进行HE染色;止血钳钳夹左侧肺根,使用1ml注射器抽取预冷在4℃冰箱中的生理盐水缓慢注入对肺组织,充分灌洗肺组织3次,0.3ml/次,并将灌洗液(BALF)注入冻存管中,尽快放入-80℃保存,BALF用于检测BALF中炎性因子IL-1β浓度。体外试验:单层培养MLE—12细胞,随机分为4组:对照组(C组)、20%牵张组(CS组)、20%+TLR4阻断剂组(CS+T组)以及线粒体电子传递链解偶联剂cccp组(cccp组),CS组与CS+T组使用细胞牵张仪进行循环性牵拉,牵张仪参数设置为:0.5 Hz,牵张和放松的时间比:1:1,牵张时间均为4小时,其中CS+T组行牵张前1h用TLR4阻断剂TAK-242(1uM)进行预处理。cccp组在后续进行实验前30min用线粒体呼吸链解偶联剂cccp(10uM)进行预处理。预处理及机械牵张结束后,每组留取等量细胞上清液置于冻存管迅速保存-80℃冰箱,用于检测细胞上清液IL-1β浓度;提前准备好冰袋,每组3孔细胞置于冰上提取蛋白总量,用于Western Blotting测NLRP3蛋白及NFκB-P65和磷酸化的NFκB-P65(NFκB-pP65)表达量;剩余细胞用JC-1法按照说明书处理后用流式细胞仪检测PE-A通道(红)、FITV-A通道(绿)平均荧光强度和线粒体来源的ROS生成量。结果:体内实验:1、HE染色发现:大潮气量机械通气后小鼠肺泡细胞连接断裂、肺泡壁增厚,肺泡腔内充血出血,伴随肺泡腔内透明膜形成。使用TLR4阻断剂后行大潮气量机械通气组肺泡腔内充血、出血减少,肺泡壁断裂、增厚均减少。2、western blotting发现,与C组和MV+T组相比MV组NLRP3蛋白和磷酸化的NFκB-P65表达均增加,其中MV+T组NLRP3蛋白和磷酸化的NFκB-P65表达较C组增加,但较MV组减少。3、酶联免疫吸附试验(ELISA)发现,与C组IL-1β浓度相比,MV组和MV+T组炎性因子表达量显著增加(P0.05),其中MV+T组IL-1β浓度较MV组降低。体外实验:1、western blotting发现,与C组相比,其余三组NLRP3蛋白和磷酸化的NFκB-P65表达量均显著增加,CS+T组NLRP3蛋白和NFκB-pP65表达量均降低,cccp组与CS组蛋白表达量无明显差异。2、流式细胞仪检测发现,与C组相比,CS组、CS+T组和cccp组细胞MMP显著下降,与CS组相比cccp组MMP水平无显著差异,加入TLR4阻断剂后行机械牵张,细胞MMP水平较CS组提高。3、ELISA发现,IL-1β浓度在C组较其余三组低,与CS组相比,cccp组IL-1β浓度无明显变化,CS+T组IL-1β浓度较CS组明显降低。结论:大潮气量机械通气能促进体内NLRP3炎性蛋白的生成和激活,继而导致线粒体MMP下降;引起肺泡上皮细胞线粒体功能障碍,进一步激活炎性体,二者相辅相成恶性循环共同加重VILI。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R563

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本文编号：1510762