维生素D在肺泡Ⅱ型上皮细胞炎症反应中干预作用的研究

发布时间：2018-02-27 04:09

  本文关键词： 肺泡Ⅱ型上皮细胞 脂多糖 炎症 维生素D　出处：《中国人民解放军医学院》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：脓毒症所致急性呼吸窘迫综合征（acute respirarory distress syndrome，ARDS）为临床常见危重症，肺泡上皮细胞损伤是其主要病理改变之一。研究显示维生素D除具有经典的调节钙磷平衡作用外，还具有免疫调节和抗肿瘤等广泛的骨外生物学效应。目前有关维生素D在组织结构细胞，，特别是脓毒症时肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar epithelial cell typeⅡ，ATⅡ）中干预作用的研究相对少见。本研究选取人ATⅡ细胞系A549为研究对象，以脂多糖为刺激因素，探究维生素D对ATⅡ炎症反应的干预作用及相关机制，为临床防治脓毒症型ARDS提供理论依据。 方法： 1.以体外培养的A549细胞为研究对象，首先，按照对照组、LPS刺激组（1μg/ml）、 LPS＋25(OH)D3（100nmol/L）干预组、 LPS＋1,25(OH)_2D_3（100nmol/L）干预组、25(OH)D（3100nmol/L）干预组、1,25(OH)2D（3100nmol/L）干预组分组；再次，按照1,25(OH)_2D_3（100nmol/L）的不同干预时间点（LPS刺激前24小时、LPS刺激前16小时、LPS刺激前6小时、LPS刺激前3小时、同时给药、LPS刺激后3小时、LPS刺激后6小时）分组；最后，按照1,25(OH)_2D_3的不同给药浓度（10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L）分组；以LPS的给药时间为起点，24小时后收集细胞培养上清。另外，给予1,25(OH)_2D_3（1μmol/L）干预，分别于LPS刺激6小时、12小时后收集细胞培养上清。通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测细胞培养上清中炎症因子白介素（interleukin，IL）-8的表达水平。 2.按照对照组、LPS刺激组（1μg/ml）、LPS＋1,25(OH)_2D_3（10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L）干预组分组；于LPS刺激A549细胞24小时后应用MTT法检测细胞增殖活力。 3．应用免疫组化、免疫荧光方法检测人正常肺组织中ATⅡ及A549细胞维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）、1-羟化酶（CYP27B1）的表达分布。 4.按照对照组、LPS刺激组、LPS＋1,25(OH)_2D_3（1μmol/L）干预组、1,25(OH)_2D_3（1μmol/L）干预组分组，在LPS刺激30分钟和24小时后收集细胞提取总蛋白，应用Western Blot方法检测NF-κB p65、IκB-蛋白的表达水平；应用免疫荧光方法检测NF-κB p65的表达及核转位。 结果： 1.1,25(OH)_2D_3可显著降低A549细胞经LPS刺激后炎症因子IL-8的表达水平（P0.05），而25(OH)D3仅轻度降低IL-8的表达水平，且无统计学差异；1,25(OH)_2D_3在七个不同干预时间点均可显著降低炎症因子IL-8的表达水平（P0.05），其中在LPS刺激前24小时给药最为明显；三个不同给药浓度的1,25(OH)_2D_3均可显著降低炎症因子IL-8的表达水平（P0.05），其中高浓度组最为明显；1,25(OH)_2D_3在LPS刺激后6小时及12小时两个时间点均可显著降低炎症因子IL-8的表达水平（P0.05）。 2. LPS（1μg/ml）组细胞增殖活力较对照组明显下降（P0.05），在LPS刺激前24小时给予1,25(OH)_2D_3（10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L）干预与LPS刺激组比较未显著影响细胞增殖活力。 3．VDR和CYP27B1在人正常肺组织ATⅡ中均有表达，VDR表达于胞核和胞浆处，CYP27B1主要表达于细胞浆。与正常ATⅡ有所不同，A549细胞的VDR主要表达于核膜和胞浆处，并且在A549细胞中未检测到CYP27B1的表达。 4．1,25(OH)_2D_3在30分钟和24小时可显著升高A549细胞和经LPS刺激后A549细胞IκB-总蛋白的表达水平，而对NF-κB p65总蛋白的表达水平无显著影响；免疫荧光检测显示1,25(OH)_2D_3可抑制LPS刺激后A549细胞NF-κB p65的核转位。 结论： 1．1,25(OH)_2D_3可显著抑制LPS致伤A549细胞炎症因子IL-8的表达，抑制程度随给药浓度的增加而增强，并且在LPS刺激前24小时干预时其抗炎作用效果最为明显。 2．1,25(OH)_2D_3对LPS致伤A549细胞的增殖活力无显著影响。 3．VDR和CYP27B1在人正常肺组织ATⅡ中均有表达，提示正常ATⅡ具有局部合成1,25(OH)_2D_3的可能，而A549细胞仅表达VDR，未检测到CYP27B1的表达，这可能是给予25(OH)D3不能在A549细胞局部经CYP27B1催化为1,25(OH)_2D_3，而发挥抗炎作用的原因之一。 4．1,25(OH)_2D_3可能通过上调IκB-蛋白的表达，抑制NF-κB p65的核转位，进而使其下游炎症因子IL-8的表达下调，从而发挥抗炎作用。
[Abstract]:Objective: sepsis induced acute respiratory distress syndrome (acute respirarory distress syndrome, ARDS) is a common clinical critical disease, alveolar epithelial cell injury is the main pathological one. Studies suggest that vitamin D is in addition to the classical regulation of calcium and phosphorus balance effect, also has the bone biological effects of immunoregulation and anti tumor etc at present. The vitamin D in the structure of cells, especially in sepsis of type II alveolar epithelial cells (alveolar epithelial cell type II, AT II) study the intervention effects are relatively rare. This study selected AT II cell line A549 as the research object, using LPS as stimuli to explore the intervention effect of vitamin D the AT II inflammatory reaction and mechanism, to provide theoretical basis for clinical prevention and treatment of sepsis and ARDS.
Method锛

本文编号：1541043