整合素αvβ6在铜绿假单胞菌LPS诱导BEAS-2B细胞EMT中的作用研究

发布时间：2018-03-02 08:46

  本文关键词： 铜绿假单胞菌 气道重塑 上皮-间质转化(EMT) 转化生长因子-β1(TGF-β1) 金属蛋白酶(MMP) 铜绿假单胞菌 气道重塑 上皮-间质转化(EMT) 整合素αvβ6 转化生长因子-β1(TGF-β1) 金属蛋白酶(MMP)　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)是临床常见的机会致病菌,具有复杂的耐药机制,可引起严重的下呼吸道感染。近年来,由于泛耐药菌株的流行,铜绿假单胞菌下呼吸道感染患者常出现抗感染疗程延长,迁延不愈,甚至导致患者病死率增加。反复感染与气道上皮的纤维化修复密切相关,后者可引起患者不可逆的肺功能下降及远期不良预后,因此,如何改善气道纤维化重塑,对于铜绿假单胞菌下呼吸道感染的患者具有重要的临床意义。上皮细胞可经上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)分化为纤维化病灶中的成纤维细胞,活化的成纤维细胞可继续分化为肌成纤维细胞,并分泌过多基质金属蛋白酶来进一步促进纤维化进程,因此,EMT是纤维化病灶中成纤维细胞的重要来源之一。我们假设,支气管上皮细胞在铜绿假单胞菌感染时可能发生EMT转化,从而引起气道纤维化重塑。整合素αvβ6是特异性表达于上皮细胞的细胞粘附分子,可以通过改变转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)前体构象,可控地上调局部TGF-β1活性。研究发现整合素αvβ6可调控肺、肾纤维化及相关上皮细胞EMT转化,这与其上调局部TGF-β1-Smad2/3信号通路相关,后者是纤维化的主要机制之一,因此我们猜想,整合素αvβ6可能通过调控TGF-β1-Smad2/3信号通路来参与铜绿假单胞菌相关的气道纤维化重塑过程,而其中和性抗体可能抑制铜绿假单胞菌相关的支气管上皮细胞EMT转化,从而改善气道纤维化重塑。本课题分为两部分:1.以铜绿假单胞菌LPS作为干预手段,支气管上皮细胞BEAS-2B为实验对象,验证EMT是否参与铜绿假单胞菌相关的气道纤维化,并探究其相关信号通路;2.以整合素αvβ6中和性抗体为治疗药物,探讨整合素ααvβ6在BEAS-2B细胞EMT过程中的作用及其机制,明确其中和性抗体对此病理过程的治疗作用,为改善铜绿假单胞菌感染相关的气道纤维化重塑提供实验依据。第一部分铜绿假单胞菌LPS诱导人支气管上皮BEAS-2B细胞EMT研究研究目的验证EMT是否参与铜绿假单胞菌相关的气道纤维化重塑,并探究其相关信号通路。研究方法(1)以铜绿假单胞菌LPS(Lipolysyccharide,LPS)2μg/ml诱导人支气管上皮BEAS-2B细胞,建立体外EMT病理模型。按LPS作用时间不同,将人正常支气管上皮BEAS-2B细胞分为:空白对照组(Con)、LPS作用24小时组、LPS作用48小时组、LPS作用72小时组,应用Western blot以及间接细胞免疫荧光法检测上皮标记蛋白E-钙黏素(E-cadherin,E-Cad)、间质标记物波形蛋白(vimentin,Vi)表达;倒置显微镜检测细胞形态学变化;(2)Western blot检测肌成纤维细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)表达水平;(3)ELISA法检测细胞培养液上清中MMP-2和MMP-9分泌浓度;(4)检测细胞培养液上清中TGF-β1水平,Western blot 检测 Smad2/3(T-Smad2/3)以及磷酸化 Smad2/3(p-Smad2/3)的表达水平;研究结果(1)铜绿假单胞菌LPS可诱导BEAS-2B细胞发生EMT转化:以铜绿假单胞菌LPS2μμg/ml分别作用24小时、48小时、72小时后,Western blot显示,与空白对照组比较,随LPS作用时间延长,BEAS-2B细胞上皮标记蛋白E-Cad表达显著下调(p0.05),而间质标记物Vi表达显著增加(p0.05);间接细胞免疫荧光亦提示,与空白对照组比较,随LPS作用时间延长,BEAS-2B细胞上皮标记蛋白E-Cad表达逐渐下降,而间质标记物Vi表达逐渐增加;倒置显微镜观察显示,与空白对照组比较,LPS作用72小时组细胞形态由类鹅卵石样上皮表型变为梭形间质样外观;(2)Western blot结果提示,与空白对照组比较,LPS作用72小时后,肌成纤维细胞标记物α-SMA表达显著上调(p0.05);(3)ELISA提示,与空白对照组相比较,LPS作用72小时后,细胞培养液上清中MMP-2和MMP-9浓度显著升高(p0.05);(4)Westernblot提示,与空白对照组比较,LPS作用72小时后,BEAS-2B细胞Smad2/3磷酸化水平升高(p0.05);ELISA提示,与空白对照组比较,LPS作用72小时后,细胞培养液上清中TGF-β1浓度显著升高(p0.05),TGF-β1-Smad2/3信号通路激活。结论(1)铜绿假单胞菌LPS可以诱导人支气管细胞BEAS-2B发生EMT;(2)伴随EMT过程,BEAS-2B细胞可过度分泌MMP-2和MMP-9,且能进一步分化为肌成纤维细胞;(3)TGF-β1-Smad2/3信号通路的激活是铜绿假单胞菌LPS诱导支气管上皮细胞EMT的潜在机制。第二部分 整合素αvβ6对铜绿假单胞菌LPS诱导BEAS-2B细胞EMT的调控作用及其机制研究目的探讨整合素αvβ6在BEAS-2B细胞EMT过程中的作用及其机制,明确整合素αvβ6中和性抗体对BEAS-2B细胞EMT及其相关生物学行为的治疗作用,为改善铜绿假单胞菌感染相关的气道纤维化重塑提供干预选择。研究方法(1)铜绿假单胞菌LPS 2μg/ml作用BEAS-2B细胞24小时、48小时、72小时,Western blot检测整合素αvβ6表达;(2)将人支气管上皮细胞BEAS-2B分为以下几组:空白对照组、LPS组、LPS+整合素αvβ6中和性抗体10D5组、LPS+TGF-β1受体特异性拮抗剂SB431542组、整合素αvβ6中和性抗体10D5组,Western blot以及间接细胞免疫荧光法检测上皮标记蛋白E-Cad、间质标记物Vi;倒置显微镜观察细胞形态学改变;(3)Western blot检测肌成纤维细胞标记物α-SMA表达水平;ELISA法检测细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9分泌浓度;(4)检测细胞培养上清液中TGF-β1分泌水平,Western blot检测T-Smad2/3以及p-Smad2/3的表达水平;研究结果(1)Western blot显示,伴随EMT过程,铜绿假单胞菌LPS可诱导BEAS-2B细胞整合素αvβ6表达显著上调(p0.05);(2)Western blot检测E-Cad和Vi蛋白表达,与空白对照组对比,LPS组BEAS-2B细胞上皮标记蛋白E-Cad表达显著下调(p0.05),而间质标记物Vi表达显著增加(p0.05);整合素αvβ6中和性抗体10D5及TGF-β1受体特异性拮抗剂SB431542治疗组可逆转EMT标记蛋白E-Cad及Vi的表达变化(p0.05);间接细胞免疫荧光提示,与空白对照组对比,铜绿假单胞菌LPS可导致BEAS-2B细胞E-Cad表达下降,而间质标记物Vi表达增加,整合素αvβ6中和性抗体10D5及TGF-β1受体特异性拮抗剂SB431542治疗组可逆转此变化;倒置显微镜观察显示,伴随EMT过程,BEAS-2B细胞形态由鹅卵石样上皮细胞外观形变为梭形间质样,整合素αvβ6中和性抗体10D5及TGF-β1受体特异性拮抗剂SB431542治疗可改善此变化;(3)Western blot提示,与空白对照组对比,铜绿假单胞菌LPS可诱导BEAS-2B细胞α-SMA表达显著上调(p0.05),整合素αvβ6中和性抗体10D5及SB431542治疗组可逆转α-SMA的上调(p0.05);ELISA提示,与空白对照组相比,铜绿假单胞菌LPS可引起BEAS-2B细胞培养液上清中MMP-2和MMP-9浓度显著升高(p0.05),整合素αvβ6中和性抗体10D5及TGF-β1受体特异性拮抗剂SB431542治疗组可改善MMP-2和MMP-9的过度分泌(p0.05);(4)Western blot提示,铜绿假单胞菌LPS可导致BEAS-2B细胞Smad2/3磷酸化水平升高(p0.05),整合素αvβ6中和性抗体10D5及TGF-β1受体特异性拮抗剂SB431542治疗组可改善此变化(p0.05);ELISA提示,铜绿假单胞菌LPS作用组细胞培养液上清中TGF-β1分泌浓度显著升高(p0.05),整合素αvβ6中和性抗体10D5治疗组可逆转活化TGF-β1的过度分泌(p0.05),而TGF-p1受体特异性拮抗剂SB431542不影响TGF-β1的分泌水平。结论(1)铜绿假单胞菌LPS诱导人支气管细胞BEAS-2B发生EMT的同时显著上调整合素αvβ6表达;(2)整合素αvβ6中和性抗体可抑制铜绿假单胞菌LPS诱导的BEAS-2B细胞EMT,抑制其进一步分化为肌成纤维细胞,改善MMP-2和MMP-9过度分泌;(3)整合素αvβ6通过激活TGF-β1-Smad2/3信号通路来介导铜绿假单胞菌LPS诱导BEAS-2B细胞EMT转化,因此可作为治疗铜绿假单胞菌感染相关气道纤维化重塑的干预靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R56

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本文编号：1555819