细胞外信号调节激酶信号通路在香烟烟雾致大鼠肺血管重塑中的调控机制

发布时间：2018-03-08 15:41

  本文选题：细胞外信号调节激酶1/2　切入点：周期蛋白E1　出处：《华中科技大学》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分细胞外信号调节激酶1/2和周期蛋白E1在香烟烟雾暴露致大鼠肺血管重塑中的表达变化 目的：探讨香烟烟雾暴露大鼠肺血管中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和周期蛋白E1(cyclinE1)的表达变化以及它们与香烟烟雾暴露致大鼠肺血管重塑程度的关系。 方法：24只成年雄性Wistar大鼠随机分为四组：C组(对照组),S-1M(烟雾暴露1月组),S-3M(烟雾暴露3月组)和S-6M(烟雾暴露6月组)。HE染色观察肺血管壁增厚情况,平滑肌细胞α肌动蛋白(α-SMA)染色观察肺小血管肌化程度。免疫组织化学染色观察ERK1/2和cyclinE1在大鼠肺动脉平滑肌中的定位表达,Western blotting法检测大鼠肺动脉平滑肌中ERK1/2和cyclinE1的蛋白表达量。 结果：随烟雾暴露时间的延长,完全肌化血管比例、肺血管壁厚度与血管直径的比值(WT)、ERK1/2和cyclinE1的蛋白表达随烟雾暴露时间延长而显著增加。ERK1/2与cyclinE1表达与大鼠肺WT值以及完全肌化血管比例成显著正相关,ERK1/2与cyclinE1的表达量之间也成显著正相关关系。 结论：香烟烟雾暴露可以导致大鼠肺血管重塑。同时,活化的ERK1/2和cyclinE1在香烟烟雾暴露大鼠肺血管中的表达显著增加且与烟雾暴露时间成正相关,提示提示活化的ERK1/2和cyclinE1可能与香烟烟雾暴露所致的大鼠肺血管重塑有关。 第二部分细胞外信号调节激酶1/2和周期蛋白E1在香烟烟雾提取物致大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用以及二者的关系 目的：探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)是否通过上调周期蛋白E1(cyclinE1)的表达进而参与调节香烟烟雾提取物(CSE)刺激培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(rPASMCs)的异常增殖。 方法：进行大鼠肺动脉平滑肌细胞的原代培养,根据本实验室以往研究结果,选择对细胞的增殖促进作用最强的2%CSE进行实验。为验证cyclinE1在CSE导致的rPASMCs增殖中的作用,将细胞分为4组：control组,2%CSE组,NCsiRNA组,CE1siRNA组。为探索ERK1/2在CSE导致的rPASMCs增殖中的作用及其对cyclinE1的调控作用,再将细胞分为另外4组：control组,2%CSE组,PD98059组,2%CSE+PD98059组。各组细胞同步化后给予2%CSE和干预药物进行共培养。使用台盼蓝染色直接细胞计数法和BrdU掺入法检测细胞增殖情况。Western blotting和免疫荧光染色检测ERK1/2和cyclinE1的蛋白表达水平。流式细胞术检测细胞周期分布。 结果：2%CSE能上调cyclinEl和磷酸化ERK1/2的表达,并进而引起rPASMCs异常增殖。cyclinE1siRNA可以抑制2%CSE对cyclinEl的上调作用,从而抑制rPASMCs的异常增殖。PD98059可以抑制2%CSE对ERK1/2的磷酸化作用和对cyclinE1的上调作用,并可以导致细胞G1期停滞和部分抑制rPASMCs的异常增殖。 结论：活化的ERK1/2在CSE诱导的rPASMCs异常增殖中发挥重要作用,其部分原因可能是通过上调cyclinE1的表达。 第三部分细胞外信号调节激酶1/2的小干扰RNA能够通过下调cyclinE1的表达而减轻香烟烟雾暴露大鼠肺血管重塑的程度 目的：探讨ERK1/2-cyclinE1信号通路在香烟烟雾暴露大鼠肺血管重塑中的作用。 方法：构建ERK1和ERK2的siRNA,分别转染至体外培养的rPASMCs内和气管注射入大鼠肺血管内,以降低rPASMCs和大鼠肺血管中的ERKl/2的表达。rPASMCs以CSE刺激培养,大鼠则暴露于香烟烟雾或者空气中12周。使用台盼蓝染色直接细胞计数法和BrdU掺入法检测细胞增殖情况。实时定量RT-PCR检测ERK1/2和cyclinE1的mRNA表达水平。Western blotting和免疫组织化学染色检测ERK1/2和cyclinEl的蛋白表达水平。流式细胞术检测细胞周期的分布。HE染色和平滑肌细胞a-SMA染色观察肺血管重塑情况。 结果:ERKl/2siRNA有效抑制了CSE刺激培养的rPASMCs中ERK1/2和cyclinE1的mRNA和蛋白表达,造成细胞G1期停滞,部分抑制细胞增殖。而在大鼠体内,ERK1/2siRNA降低了香烟烟雾暴露大鼠肺血管中ERK1/2和cyclinE1的mRNA和蛋白表达,减轻了大鼠肺血管重塑程度。 结论：ERK1/2-cyclinEl信号通路在香烟烟雾暴露大鼠肺血管重塑中具有重要作用,ERK1/2siRNA可以通过下调cyclinE1表达而改善大鼠肺血管重塑程度。
[Abstract]:Part 1 expression of extracellular signal regulated kinase 1/2 and cyclin E1 in pulmonary vascular remodeling in rats exposed to cigarette smoke
Objective: To investigate the expression changes of extracellular signal regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and cyclin E1 (cyclinE1) in pulmonary vessels of cigarette smoke exposed rats and their relationship with the degree of pulmonary vascular remodeling in rats exposed to cigarette smoke.
Methods: 24 adult male Wistar rats were randomly divided into four groups: group C (control group), S-1M (January, S-3M smoke exposure group (March) smoke exposure group) and S-6M (June, smoke exposure group) to observe the pulmonary vascular wall thickening,.HE staining, smooth muscle actin (alpha -SMA) staining. Muscularization degree. To observe the localization of ERK1/2 and cyclinE1 in pulmonary arterial smooth muscle of rats the expression of immunohistochemical staining, the expression of ERK1/2 and cyclinE1 detection of rat pulmonary artery smooth muscle Western blotting in protein level.
Results: with exposure time prolonging, fully vascularized muscle ratio, the ratio of pulmonary vascular wall thickness and vessel diameter (WT), the expression of ERK1/2 and cyclinE1 protein with smoke exposure time increased.ERK1/2 and cyclinE1 expression in WT rats with pulmonary vascular muscle ratio value and completely positively related to it was a significant positive correlation between the expression of ERK1/2 and cyclinE1.
Conclusion: cigarette smoke exposure can lead to pulmonary vascular remodeling in rats. At the same time, the activation of ERK1/2 and cyclinE1 expression in pulmonary vessels exposed to cigarette smoke in rats increased significantly and the smoke exposure time is positively related, suggesting that pulmonary vascular remodeling in rats suggests that ERK1/2 and cyclinE1 may be activated and induced by cigarette smoke exposure.
The second part is the role of extracellular signal regulated kinase 1/2 and cyclin E1 in the proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells induced by cigarette smoke extract and the relationship between the two.
Objective: To investigate whether extracellular signal regulated kinase 1/2 (ERK1/2) can regulate the abnormal proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells (rPASMCs) stimulated by cigarette smoke extract (CSE) by up regulating the expression of cyclin E1 (cyclinE1).
Methods: primary cultured rat pulmonary artery smooth muscle cells, according to the previous research results, selection of cell proliferation promoting effect of the strongest 2%CSE experiment. In order to verify cyclinE1 in CSE induced rPASMCs proliferation, cells were divided into 4 groups: control group, 2%CSE group, NCsiRNA group, CE1siRNA ERK1/2 in CSE group. In order to explore the cause of rPASMCs proliferation and the regulation effect on cyclinE1, and then the cells were divided into 4 groups: control group, 2%CSE group, PD98059 group, 2%CSE+PD98059 group. The cells were synchronized after treated with 2%CSE and drug intervention were co cultured. Trypan blue to direct cell counting method and BrdU incorporation method of cell proliferation was detected by.Western blotting and immunofluorescence staining of ERK1/2 and cyclinE1 protein expression levels. To detect the distribution of cell cycle by flow cytometry.
Results: 2%CSE could up regulate the expression of cyclinEl and phosphorylation of ERK1/2 and rPASMCs, and cause abnormal proliferation of.CyclinE1siRNA can inhibit the up regulation of 2%CSE on cyclinEl, thereby inhibiting abnormal proliferation of.PD98059 rPASMCs can inhibit 2%CSE phosphorylation of ERK1/2 and up regulation of cyclinE1, and can lead to cell G1 arrest and inhibition of rPASMCs abnormal proliferation.
Conclusion: activated ERK1/2 plays an important role in the abnormal proliferation of rPASMCs induced by CSE, partly due to the up-regulation of cyclinE1 expression.
The third part of the small interference RNA of extracellular signal regulated kinase 1/2 can reduce the degree of pulmonary vascular remodeling in cigarette smoke exposed rats by downregulating the expression of cyclinE1
Objective: To investigate the role of ERK1/2-cyclinE1 signaling pathway in pulmonary vascular remodeling in rats exposed to cigarette smoke.
Methods: siRNA construction of ERK1 and ERK2, were transfected into rPASMCs in vitro and tracheal injection into the pulmonary arteries in rats, in order to reduce the expression of.RPASMCs in pulmonary vascular rPASMCs and ERKl/2 in the rat with CSE stimulated rats were exposed to cigarette smoke or air for 12 weeks. Using trypan directly cell counting and BrdU incorporation assay was used to detect proliferation of blue staining. The expression level of.Western blotting and immunohistochemistry were used to detect ERK1/2 and cyclinEl protein quantitative real-time RT-PCR detection of ERK1/2 and cyclinE1. The expression level of mRNA staining was used to observe the distribution of pulmonary vascular remodeling in.HE cell cycle was measured by flow cytometry staining of smooth muscle cells a-SMA.
Results: the expression of mRNA and ERK1/2 protein and cyclinE1 ERKl/2siRNA inhibited CSE stimulated rPASMCs, caused G1 cell cycle arrest, partial inhibition of cell proliferation. In rats, ERK1/2siRNA reduced cigarette smoke exposure mRNA and protein expression of ERK1/2 and cyclinE1 of pulmonary vessels in rats, reduce the pulmonary vessels of rats the degree of remodeling.
Conclusion: ERK1/2-cyclinEl signaling pathway plays an important role in pulmonary vascular remodeling in cigarette smoke exposed rats. ERK1/2siRNA can improve pulmonary vascular remodeling by downregulating cyclinE1 expression.

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R563

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