凋亡相关点样蛋白（ASC）在哮喘小鼠气道炎症中作用研究

发布时间：2018-03-13 22:32

本文选题：小鼠　切入点：哮喘　出处：《南方医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景近20年来,世界范围内的哮喘患病率呈上升趋势,支气管哮喘已成为全球最常见的慢性呼吸道疾病。据统计,我国约有2000～3000万哮喘患者,且呈现不断上升的趋势。临床上对于哮喘的急性发作、治疗以及对哮喘发作的预防工作尚未取到十分满意效果。近年来,在临床研究中我们发现与遗传因素无明显相关的非过敏性哮喘患病及诊断率存在上升趋势,临床治疗效果较差,对患者生活质量产生较大威胁。因此,对支气管哮喘具体发病机制的深入探讨、寻找新的治疗手段以及预防哮喘的靶点方向,是呼吸系病学者在疾病研究中的重点和热点。支气管哮喘作为一种呼吸系统常见的变态反应性疾病,其发病涉及多种炎症细胞、炎性介质,血清Ig (Immunoglobulin) E增高、肺组织炎症细胞浸润、气道高反应性是其显著的临床表现。气道炎症、气道高反应性、气道重塑是哮喘的三个显著临床特征。Thl/Th2免疫失衡是已被接受哮喘最重要的异常免疫学发病机制。大多数哮喘患者为过敏性哮喘,发病常与接触变应原有关。业已发现,屋尘螨、细菌毒素、鸡卵蛋白、木棉等都可认为是变应原,长期多次暴露于其中是哮喘主要的致病诱因。革兰阴性细菌脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)就是其中的毒素之一。目前,有不少研究指出不同浓度的LPS可能会诱导不同程度的Th1、Th2免疫应答反应,临床研究尚未引起重视。Eisenbarth等研究发现低浓度(0.1μg/ml) LPS可诱导产生Th2免疫应答,而较高浓度(100μg/ml)LPS则偏向诱导Thl免疫应答,这一观点证实LPS暴露水平高低可以决定机体产生炎症反应的类型。同时,LPS能通过PRPs(pattern recognition receptors, PRRs)中的TLRs (Toll-like receptors)或NLRs(NOD-like receptors)导致IL(Interleukin)-1的释放量增加,使幼稚T细胞偏向Th17细胞发展成熟。气道上皮细胞是除炎症细胞和炎症介质之外参与气道炎症发生与发展的细胞层面结构。研究证明,人气道上皮细胞(human bronchial epithelial cell, HBE)除可以作为气道的第一道防线发挥固有免疫作用外,在获得性免疫激活与发展过程中也存在重要作用。近年来,炎症复合体(Inflammasome)被认为可能是多种炎症性疾病获得性免疫被激活的关键,其中被研究最多的就是NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrin domain3)炎症复合体。蛋白受体NLRP3、凋亡相关点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和半胱氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)共同组成的多蛋白复合体即是NLRP3炎症复合体。其中的蛋白受体NLRP3能通过接头蛋白ASC接合pro-Caspase-1,形成上述NLRP3inflammasome,受体信号的传导可激活pro-Caspase-1,形成有活性的Caspase-1。而既往对炎症复合体的研究证实,Caspase-1是促进IL-1家族细胞因子成熟与释放的关键酶水解因素,从而使IL-1家族细胞因子参与后续炎症因子分泌及炎症反应的发生。本课题选择BALB/c小鼠和人气道上皮细胞(16HBE)作为研究对象,利用动物模型及体外实验观察哮喘小鼠模型及人气道上皮细胞中接头蛋白ASC的表达情况及下游细胞因子IL-1p的分泌情况,并通过siRNA技术阻断ASC在16HBE中的表达,观察其对Caspase-1、IL-1β表达的改变,证实ASC在气道炎症中的作用,从而为完善哮喘气道炎症机制研究提供参考。目的建立OVA致敏和激发BALB/c雌性小鼠哮喘模型,观察LPS处理模型建立后与前者有无不同。方法SPF级雌性BALB/c小鼠(南方医科大学实验动物中心)24只,随机分为3组,每组小鼠各8只,分别为PBS对照组(A)、哮喘组(B), LPS干预组(C)。以去蛋白饲料和普通饮用水分笼饲养。各组小鼠分别于第0、7、14天进行致敏：A组小鼠以生理盐水200μl腹腔注射,B、C组小鼠以V级OVA溶液200μl腹腔注射,其中C组小鼠在第18-20天另予10μg LPS溶液腹腔注射。第21天起将各组小鼠置于玻璃雾化吸入瓶中,由WH-2000超声波化器提供动力,A组以40ml PBS溶液雾化吸入,B、C组以Ⅱ级OVA40ml雾化吸入。每次激发时间30min,连续雾化7天。注意观察并记录造模期间小鼠食量、行为学等方面变化。末次激发24h后,以乙酰甲胆碱雾化各组小鼠,用BUXCO无创肺功能检测仪检测小鼠气道反应性监测指标增强呼气间歇(Penh)值。行支气管肺泡灌洗术,将肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中细胞沉渣取出进行细胞计数；涂片并染色计数细胞分类；取右上肺(未灌洗),作石蜡切片行常规HE染色,光学显微镜下观察组织形态,气管和血管周围炎症细胞浸润情况。结果 1.模型制备中小鼠行为学观察：在致敏及激发过程中观察小鼠反应。发现A组无明显异常症状,B、C组小鼠出现典型哮喘发作症状,如烦躁不安、二便失禁、口唇紫绀、流涎、呼吸急促等,以上可证实模型制作成功。 2.无创肺功能检测气道反应性结果：各组小鼠经气道反应性检测,其气道高反应性由呼吸间歇值(Penh)表达。从基线值开始按浓度顺序激发,到乙酰甲胆碱浓度为3.125mg/ml时,三组小鼠的Penh值变化无统计学差异,其P0.05；而当乙酰甲胆碱浓度为6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml时,各组Penh值比较,B组明显高于A组和C组,差异有统计学意义(均P0.05)。 3.BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比、中性粒细胞百分比：①BALF细胞计数：B组为(54.60±0.67)×104/ml高于A组为(11.55±0.69)×104/ml:C组为(73.45±0.75)×104/ml,明显高于A、B两组(其中F=57.421,P=0.000)。②BALF嗜酸性粒细胞百分数：A组为(5.06±2.10)%,B组为(17.96±4.46)%,C组为(11.20±0.48)%,A、B与A、C间比较,P0.05,差别有统计学意义；而B、C间比较,P=0.156,二者间差别无统计学意义。③BALF中性粒细胞百分数：A组(7.41＋0.94)%,B组：(12.9±0.69)%,C组：(17.03＋0.57)%。各组间比较P0.05,差别有统计学意义。 4.肺组织病理学观察结果：A组小鼠肺组织基本无炎症浸润；B组可见炎症反应；C组小鼠细支气管壁肿胀,其周围可见大量炎症细胞浸润,并有杯状细胞增生,较B组炎症有所加重。结论雌性BALB/c小鼠以OVA腹腔注射致敏并雾化激发的方法可成功建立小鼠哮喘模型,其气道炎症符合哮喘的病理生理改变。10μg剂量LPS可加重哮喘小鼠气道上皮炎症,使传统哮喘模型向非嗜酸性粒细胞型转向。第二部分哮喘小鼠肺部ASC表达情况和L-1p的分泌目的观察哮喘小鼠肺部ASC表达情况和下游细胞因子L-1p的释放情况,探讨ASC影响炎症表达的可能机制。方法 1.取第一部分各组小鼠肺组织的石蜡切片脱蜡、水化,经抗原修复、抗体结合、苏木素复染等步骤后封片。光学显微镜下观察各组小鼠肺组织中ASC的主要表达部位及表达量。 2. BALF液离心后取上清,参照酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒说明书进行IL-1p检测。结果 1.炎症复合体中ASC在肺组织中表达情况：对比A、B、C各组,B组小鼠气道上皮中ASC表达高于A组,而予LPS刺激的C组,其气道上皮中ASC的表达情况则明显高于A、B组。 2.IL-1p的分泌：C组BALF上清IL-1β(9.45±1.20) pg/mg,明显高于B组(4.97±1.23)pg/mg及A组(3.11±0.98)pg/mg,各组间P0.05,差别有统计学意义。结论ASC参与哮喘中炎症反应的发生；10μg剂量LPS可加重哮喘小鼠气道上皮炎症,并使ASC在哮喘炎症中的参与量增加。第三部分siRNA干扰人气道上皮细胞ASC表达后对Caspase-1、IL-1β影响研究目的对人气道上皮细胞中ASC靶向干扰,检测干扰效果,筛选出最有效的干扰序列。观察LPS诱导干扰前后的16HBE细胞中Caspase-1、IL-1β蛋白表达情况的影响。方法以ASC为目标基因,设计并合成三条ASC-siRNA序列,lipofecamineTM NAiMAX为媒介转染至细胞,用Realtime-PCR和Western blot技术检测不同沉默序列对ASCmRNA及蛋白表达的影响。取有效干扰组、空白组为实验对象,分别予以下处理：①PBS空白对照处理；②LPS组：加LPS(100ng/ml)培养18h；③ATP组：外源性ATP(5mmol/L)处理2h；④LPS+ATP组：外源性ATP (5mmol/L)预处理2h后再加入LPS (100ng/ml)培养至18h。Western blot检测各组细胞Caspase-1、IL-1β的表达。结果 1.ASC-siRNA序列片段经lipofecamineTM RNAiMAX转染16HBE细胞后,ASCmRNA及蛋白表达较对照组明显降低。ASC-siRNA-499干扰序列,转染浓度2μg/ml、转染时间48h (ASC mRNA)及72h(蛋白)表达较其他(序列/浓度/时间)组别明显降低。 2.单纯ATP刺激正常细胞,后续炎症因子Caspase-1、IL-10较空白对照组无明显不同；而相比单独使用LPS刺激的正常细胞,以ATP预处理2h再使用LPS刺激后,该组所能检测到的Caspase-1及IL-1β量较之增多,其中Caspase-1增多较明显；以ASC-siRNA-499干扰后的细胞,单纯LPS、LPS联合ATP处理,所得到的炎症因子Caspase-1、IL-1β都较非干扰细胞减弱。结论LPS、外源性ATP以第一、二信号方式参与气道上皮细胞中NLRP3炎症复合体的活化过程,NLRP3炎症复合体中的ASC参与caspase-1活化量与炎症因子IL-1p分泌量的调控。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R562.25

【参考文献】