去甲基化对香烟提取物所致小鼠肺气肿模型及内皮祖细胞功能和干细胞抗原-1表达的作用

发布时间：2018-03-28 09:45

  本文选题：肺气肿　切入点：动物模型　出处：《中南大学》2013年博士论文

【摘要】：第一章5-杂氮-2'-脱氧胞苷对香烟提取物所致小鼠肺气肿模型和干细胞抗原-1表达的影响 目的：探讨经腹腔注射香烟提取物(Cigarette Smoking Extract,CSE)所致肺气肿小鼠模型的建立,腹腔注射5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine, AZA)对肺气肿动物模型的保护作用和对干细胞抗原-1(Stem Cell Antigen-1, Sca-1)表达的影响。 方法：32只4-6周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组(N组)、AZA (A组)、CSE+AZA (AC组)及CSE(C组),每组8只,定时定量腹腔注射CSE溶液/AZA溶液/PBS溶液,第28天处理四组小鼠,检测体重变化、Buxco系统及PLY3211小动物肺功能检测系统行肺功能检查、收集标本。肺组织病理切片苏木素-伊红(HE)染色后观察形态学改变并定量测定平均肺泡隔厚度(MAST)、平均内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI),肺组织TUNEL染色检测肺泡间隔细胞凋亡。 将动物模型于造模第28天处死,密度梯度离心法分离小鼠骨髓EPCs并培养7天,Western Blotting检测各组EPCs及肺组织Sca-1蛋白表达,实时定量RT-PCR检测各组EPCs及肺组织Sca-1mRNA表达。 结果：(1)(i)4组小鼠体重变化均无统计学差异(P0.05)。(ii)肺功能比较中,与正常对照组比较,AC组及C组小鼠气道阻力(Raw)显著增高(P0.01),动态肺顺应性(Cdyn)、呼气峰流速(PEF)及吸呼比(Ti/Te)降低(P0.05或P0.01),AC组和C组之间肺功能各指标无统计学差异(P0.05)。(iii)小鼠肺组织HE染色,形态学变化明显,C组肺组织可见肺实质破坏,肺泡间隔断裂,肺泡壁变薄,肺泡腔融合、高度扩大,肺气肿明显。各组MAST比较：与N组比较,A组、AC组和C组MAST均显著降低(P0.01)；与A组比较,AC组和C组MAST显著降低(P0.01)；与AC组比较,C组MAST降低(P0.05)。各组MLI比较：与N组比较,A组、AC组和C组MAST增高(P0.05或P0.01)；与A组比较,AC组和C组MAST显著增高(P0.01)；与AC组比较,C组MAST增高(P0.05)。各组DI比较：与N组比较,A组、AC组和C组MAST均显著增高(P0.01)；与A组比较,AC组和C组MAST显著增高(P0.01)；与AC组比较,C组MAST增高(P0.05)。(iv)肺组织TUNEL染色,与N组比较,AC组和C组AI显著增高(P0.01)；与A组比较,AC组和C组AI显著增高(P0.01)；与AC组比较,C组AI显著增高(P0.01)。 (2)(i)各组EPCs的Sca-1蛋白表达比较：与N组比较,AC组和C组Sca-1蛋白表达量显著降低(P0.01)；与A组比较,AC组Sca-1蛋白表达量降低(P0.05),C组Sca-1蛋白表达量显著降低(P0.01)；与AC组比较,C组Sca-1蛋白表达量显著降低(P0.01)。(ii)各组EPCs的Sca-1mRNA表达比较：与N组比较,AC组和C组Sca-1mRNA表达量显著降低(P0.01)。与A组比较,AC组和C组Sca-1mRNA表达量显著降低(P0.01)。与AC组比较,C组之间Sca-1mRNA表达量降低(P0.05)。(iii)各组肺组织的Sca-1蛋白表达比较：与N组比较,A组、AC组和C组Sca-1蛋白表达量均显著降低(P0.01)；与A组比较,AC组和C组Sca-1蛋白表达量显著降低(P0.01)；与AC组比较,C组Sca-1蛋白表达量显著降低(P0.01)。(iv)各组肺组织的Sca-1mRNA表达比较：与N组比较,A组、AC组和C组Sca-1mRNA表达量显著降低(P0.01)。与A组比较,AC组和C组Sca-1mRNA表达量显著降低(P0.01)。与AC组比较,C组Sca-1mRNA表达量降低(P0.05)。 结论：(1)腹腔内注射CSE可成功建立小鼠肺气肿模型,缩短建模周期,且肺部形态学改变早于功能改变。(2)去甲基化剂可能通过部分逆转CSE对骨髓EPCs及肺组织Sca-1表达的抑制作用,而发挥对肺气肿动物模型肺功能和肺组织形态学的保护作用。(3)表观遗传学DNA甲基化机制参与了肺气肿的发病机制。 第二章5-杂氮-2’-脱氧胞苷对香烟提取物所致内皮祖细胞功能及其干细胞抗原-1表达的影响 目的：观察干细胞抗原-1(Stem Cell Antigen-1, Sca-1)在正常小鼠内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)上的表达,以及5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine, AZA)对香烟提取物(Cigarette Smoking Extract,CSE)所致EPCs功能及其Sca-1蛋白表达的影响。 方法：采用密度梯度离心法分离小鼠骨髓EPCs并培养；通过观察细胞形态学改变、对培养第7天的贴壁细胞行DiI-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双染鉴定及流式细胞术检测细胞表面标志物,综合鉴定EPCs;采用流式细胞术检测EPCs上Sca-1的表达。 采用不同浓度和不同干预时间,用CSE溶液、AZA溶液体外干预培养7天的小鼠EPCs,采用噻唑蓝比色法(MTT法)检测EPCs增殖能力,选择最佳干预浓度和干预时间进行后续干预试验。采用贴壁细胞计数检测EPCs粘附能力,培养液中NO浓度测定检测EPCs分泌能力。 将培养第7天的EPCs分为四组：正常EPCs组(对照组,N组),2umol/L AZA干预组(A组),1%CSE+2umol/L AZA干预组(AC组)和1%CSE干预组(C组),采用western-blot检测各组Sca-1蛋白表达。 结果：(1)培养7天的EPCs呈梭形、纺锤形或多边形,可形成首尾相连网状血管样结构,亦可呈铺路石样外观。其DiI-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双染阳性率为(94.67±4.16)%,其特异性表面抗原FITC-CD34、PE-CD133、APC-Flk-1三阳表达率为(95.07±1.73)%,加上PerCP-Sca-1后的四阳表达率(94.00±1.67)%,其中EPCs的Sca-1阳性表达率为(98.87±0.24)%。 (2)(i)不同浓度和不同时间CSE干预后EPCs增殖能力比较：CSE干预3小时,与对照组比较,1%CSE和2.5%CSE组细胞OD值显著增加(P0.05),5%CSE和10%CSE组细胞OD值显著下降(P0.01)；CSE干预6小时,与对照组比较,1%CSE组细胞OD值显著增加(P0.05),2.5%CSE、5%CSE和10%CSE组细胞OD值显著下降(P0.01)；CSE干预24小时,与对照组比较,各CSE浓度干预均使细胞OD值下降(P0.01)。(ii)选择1%CSE和干预24小时时间点,比较不同浓度5-azaC干预后的EPCs增殖能力：与对照组比较,1%CSE组,1%CSE+2umol/L AZA组,1%CSE+5umol/LAZA组细胞OD值均下降(P0.05)；与1%CSE组比较,1%CSE+2umol/L AZA组,1%CSE+5umol/L AZA组细胞OD值增加(P0.05);1%CSE+2umol/L AZA组,1%CSE+5umol/L AZA组细胞OD值差异无统计学意义(P0.05)。(iii)选择1%CSE+2umol/LAZA和干预24小时时间点,比较各组EPCs粘附能力和分泌能力：对照组(N组)、1%CSE+2umol/L AZA组(AC组)和1%CSE组(C组),EPCs贴壁细胞计数比较为：与N组比较,AC组和C组贴壁细胞数显著降低(P0.01),与AC组比较,C组贴壁细胞数显著降低(P0.01)。对照组(N组)、1%CSE+2umol/L AZA组(AC组)和1%CSE组(C组),EPCs培养液中NO浓度比较为：与N组比较,AC组和C组浓度显著降低(P0.01),AC组和C组之间无统计学差异(P0.05)。 (3)正常EPCs组(对照组,N组),2umol/L AZA干预组(A组),1%CSE+2umol/L AZA干预组(AC组)和1%CSE干预组(C组)4组EPCs上Sca-1蛋白表达比较：与N组比较,C组Sca-1蛋白表达显著降低(P0.01),AC组及A组Sca-1蛋白表达差异无统计学意义(P0.05)；与C组比较,N组,AC组,A组Sca-1蛋白表达均显著上升(P0.01)；AC组和A组之间Sca-1蛋白表达差异无统计学意义(P0.05)。 结论：(1)小鼠EPCs高表达Sca-1基因。(2)短时间低浓度的CSE干预使得EPCs的增殖功能代偿性增强,延长干预时间和／或提高干预浓度都将使EPCs的功能降低,甚至完全抑制,呈时间和浓度依赖。(3)DNA甲基化转移酶抑制剂能部分逆转CSE对EPCs上Sca-1蛋白表达的抑制作用,同时改善EPCs的功能,EPCs上Sca-1蛋白表达和EPCs功能改变趋势一致,提示DNA甲基化参与了EPCs功能受损机制,Sca-1DNA甲基化可能参与了EPCs功能受损机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R563.3

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本文编号：1675792