ALI时肺内TREMs家族表达谱的变化、TREM-2的保护作用及血管活性肠肽的调控

发布时间：2018-04-04 00:42

本文选题：急性肺损伤　切入点：髓样细胞表达触发受体-2　出处：《中南大学》2012年博士论文

【摘要】：急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是多种呼吸系统疾病的共同通路,其发生发展过程可分为早期的急性炎性损伤、中期的肺细胞激活与成纤维细胞增殖以及后期的肺组织胶原沉积三个阶段。革兰氏阴性菌引起的感染是ALI的主要致病因素,其外膜上的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可活化多种炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞等,使大量炎症因子释放失控并产生放大效应,进而打破炎症自限机制,产生自身破坏性的过度炎症反应,使机体出现呼吸窘迫、非心源性肺水肿及低氧血症等。因此,寻找在ALI早期可切断炎症启动和自动瀑布式反应的治疗靶点,从而促进肺组织的损伤修复,具有重要的临床意义。肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage, AM)是肺内接触抗原最早的常驻细胞,参与肺内早期炎症的启动与维持。AM作为吞噬细胞吞噬、杀死和消化微生物,是固有免疫的重要组成部分,在适应性免疫应答的多个阶段中发挥重要作用,其功能状态可影响ALI的发生发展。AM表面表达多种可识别病原体的受体,如Toll样受体(toll like receptor, TLR)、趋化性细胞因子受体及清道夫受体等,这些受体激活后,可向胞内传递免疫调节信号,是ALI早期炎症启动的主要因素之一。肺成纤维细胞的主要功能是分泌细胞外基质的前体,维持肺组织结构的完整性,是ALI时参与肺损伤修复的重要效应细胞之一。髓样细胞触发受体(triggering receptors expressed on myeloid cells, TREMs)是一种与激活自然杀伤细胞受体同源的IgG样受体。人类TREMs家族已确认的成员有6个,主要以膜型受体和可溶型受体两种形式存在,膜型受体包括TREM-1、TREM-2、TREM-3、TREM样受体-1(TREM like receptor-1,TLT-1)、TLT-2及TLT-4；而可溶型受体有sTREM-1、sTREM-2和sTLT-1。其中TREM-2是一种主动免疫抑制性受体,可诱导趋化因子的表达,并促使树突状细胞从周围淋巴结转移到主干淋巴结,最终起到调节树突状细胞功能的作用；抑制TLR配体对巨噬细胞的激活；促进骨髓来源的巨噬细胞对细菌的吞噬,提示TREM-2可潜在调控并改善严重脓毒血症和慢性炎症。本课题观察到TREM-2在AM和成纤维细胞表达较为丰富。因此,深入研究TREM-2对AM炎症启动与放大和对成纤维细胞凋亡的影响,可明确TREM-2在ALI早期的作用及地位,有利于阐明ALI的发病机制,筛选新的治疗靶点。血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)是肺内含量最为丰富的神经肽之一,具有增强支气管上皮细胞的趋化迁移、扩张血管、舒张气道平滑肌、清除氧自由基及抗细胞凋亡等多种生物学作用。肺内VIP是否可通过调控TREM-2的表达,使ALI时肺内炎症反应和损伤修复处于对机体有利而又不会造成组织器官损伤的范围内值得探讨。目的：分析ALI时肺内TREMs家族表达谱的变化,探讨TREM-2在肺内的功能以及VIP对TREM-2的表达调控。方法：(1)腹腔注射LPS复制小鼠ALI动物模型,采用Buxco小动物呼吸功能检测系统和形态学指标验证模型的建立；RT-PCR和Western Blot法检测肺组织中TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4的表达；RT-PCR和流式细胞术检测AM、成纤维细胞、支气管上皮细胞及肺泡Ⅱ型上皮细胞TREM-1、TREM-2、 TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4的表达。(2)构建pEGFP-N1/TREM-2重组质粒并转染AM,采用荧光显微镜、RT-PCR及流式细胞术检测TREM-2重组质粒的转染和表达；RT-PCR和ELISA检测TREM-2对LPS应激的AM中TNF-a和IL-10表达的影响; RT-PCR检测TREM-2对LPS应激的AM中NF-κB mRNA表达的影响,免疫荧光检测TREM-2对LPS应激的AM中NF-κB核转位的影响。(3)pEGFP-N1质粒和pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染至成纤维细胞,采用荧光显微镜和Real-time PCR检测pEGFP-N1/TREM-2重组质粒的转染和表达；流式细胞术和PI染色检测TREM-2对成纤维细胞凋亡的影响；RT-PCR和凋亡蛋白活性检测试剂盒检测成纤维细胞caspase3、 caspase8及caspase9的表达和活性。(4)构建pGC-FU-VIP重组慢病毒并感染昆明小鼠；RT-PCR和Western Blot检测VIP对ALI小鼠肺组织中TREM-2表达的影响,并采用Real-time PCR和流式细胞术检测VIP对LPS应激的巨噬细胞TREM-2表达的调控及其机制。结果： 1.ALI时小鼠肺内TREMs家族的表达谱分析 (1) Buxco小动物肺功能检测显示：ALI小鼠的呼吸频率、肺顺应性、潮气量均低于正常小鼠；而ALI小鼠气道阻力明显大于正常小鼠的气道阻力(P0.05)。进一步采用HE染色观察到ALI小鼠的肺泡隔增厚,大量炎性细胞浸润,渗出明显增加。 (2) TREMs家族的主要成员TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4在正常小鼠肺组织中均有表达,其中以TREM-1的表达最少,TREM-2的表达最多。与正常组相比,ALI组小鼠肺组织中TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2和TLT-4mRNA的表达均明显升高,而TREM-2mRNA的表达降低(P0.05)。Western Blot检测TREM-1和TREM-2表达的结果与RT-PCR结果一致。 (3) RT-PCR检测结果显示：静息状态的成纤维细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞及支气管上皮细胞均表达TREM-2mRNA,但未见明显的TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4mRNA的表达；静息状态的AM表达TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4mRNA,而LPS应激的AM中TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4mRNA表达均升高,但TREM-2mRNA表达降低(P0.05)。流式细胞术检测结果与上述RT-PCR结果一致。 2. pEGFP-N1/TREM-2重组质粒的构建及TREM-2对AM炎症启动和放大效应的影响 (1)成功构建pEGFP-N1/TREM-2重组质粒,并转染至AM。荧光显微镜检测显示转染效率约为40%。RT-PCR和流式细胞术检测检测显示pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组AM中TREM-2表达明显高于pEGFP-N1质粒转染组(P0.01)。 (2) RT-PCR检测显示LPS应激的AM中TNF-a mRNA表达明显增加。与LPS+pEGFP-N1质粒组相比,LPS+pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组的AM中TNF-a mRNA表达明显降低。ELISA检测结果显示LPS+pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组AM的上清液中TNF-a蛋白含量(260.64±47.58) pg/mL明显低于LPS+pEGFP-N1质粒转染组(352.16±43.82) pg/mL(P0.05)。 (3) RT-PCR检测表明：与LPS+pEGFP-N1质粒转染组相比,LPS+pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组AM中IL-10mRNA表达明显升高。ELISA检测结果显示LPS+pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组AM的上清液中IL-10蛋白含量(242.96±63.23) pg/mL明显高于LPS+pEGFP-N1质粒转染组(184.38±34.33) pg/mL (P0.05)。 (4)LPS组的AM中NF-κB mRNA的表达明显高于正常对照组；LPS+pEGFP-N1质粒转染组的AM中NF-κB mRNA的表达明显高于pEGFP-N1质粒转染组；而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组AM中NF-κB mRNA的表达明显低于LPS+pEGFP-N1质粒转染组(P0.05)。与正常对照组相比,LPS应激的AM中NF-κB的核转位明显增多；LPS+pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组AM中NF-κB核转位明显少于LPS+pEGFP-N1质粒转染组。 3. TREM-2对小鼠成纤维细胞凋亡的影响 (1)pEGFP-N1和pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染至小鼠成纤维细胞后,Real-time PCR检测显示pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组的小鼠成纤维细胞TREM-2mRNA表达明显高于pEGFP-N1质粒转染组(P0.01)。 (2)流式细胞术检测结果显示：pEGFP-N1质粒转染组小鼠成纤维细胞G1期百分比(70.88%±1.17%)高于pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组(67.13%±1.35%),且pEGFP-N1质粒转染组小鼠成纤维细胞的凋亡率(0.96%±0.16%)大于pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组(0.66%±0.05%)。PI染色结果表明：LPS处理可显著增加成纤维细胞凋亡细胞的百分比,而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组(23.67%±8.08%)中凋亡细胞的百分比明显低于LPS+pEGFP-N1质粒转染组(59.33%±17.34%)(P0.01)。 (3)与正常对照组相比,LPS应激的小鼠成纤维细胞caspase3、 caspase8和caspase9mRNA表达升高,而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组小鼠成纤维细胞caspase3、caspase8和caspase9mRNA表达明显低于LPS+pEGFP-N1质粒转染组(P0.05)。LPS应激的小鼠成纤维细胞caspase3、caspase8及caspase9活性均显著强于正常对照组,而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重组质粒转染组的小鼠成纤维细胞caspase3、caspase8及caspase9活性均弱于LPS+pEGFP-N1质粒转染组(P0.05)。 4.VIP对ALI时TREM-2的表达调控 (1) pGC-FU-VIP重组慢病毒构建成功后,荧光显微镜观察到肺内绿色荧光强度与pGC-FU-VIP重组慢病毒滴度呈正相关。RT-PCR检测显示ALI小鼠肺组织VIP mRNA表达升高,而感染pGC-FU-VIP重组慢病毒的ALI小鼠肺组织中VIP mRNA表达明显高于ALI组及感染pGC-FU慢病毒的ALI小鼠(P0.01)。 (2)与正常对照组相比,ALI组小鼠肺组织TREM-2mRNA表达降低,而VIP可增加ALI组小鼠肺组织TREM-2mRNA表达(P0.01)。不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7和10-6mol/L)的VIP对静息状态的巨噬细胞TREM-2表达无明显影响(P0.05)；VIP(10-8mol/L)处理后不同时间点(0、2、4、6、12和24h)巨噬细胞TREM-2mRNA表达无明显变化(P0.05)；VIP可呈剂量和时间依赖性上调LPS应激的巨噬细胞TREM-2mRNA的表达(P0.05)。流式细胞术检测显示VIP对静息状态的巨噬细胞TREM-2表达无明显影响,但可增加LPS应激的巨噬细胞TREM-2的表达(P0.01)。 (3)RT-PCR检测表明VIP受体拮抗剂可减少VIP对LPS应激的巨噬细胞TREM-2mRNA的表达(P0.05)。流式细胞术检测显示：与LPS+VIP组相比,LPS+VIP+VIP受体拮抗剂组巨噬细胞TREM-2蛋白表达降低(P0.05)；与LPS+VIP组相比,信号通路阻断剂H-89和PD98059可降低巨噬细胞TREM-2的表达(P0.01)。 (4)通过JASPAR和IFTI数据库对调控小鼠肺内TREM-2表达的转录因子进行生物信息学分析,结果显示AP1和NF-κB可能是调控TREM-2表达的核心转录因子；Real-time PCR检测表明VIP可增加LPS应激的巨噬细胞AP1mRNA的表达(P0.05)。流式细胞术检测结果显示：采用NF-κB抑制剂可增加LPS应激的巨噬细胞TREM-2的平均荧光强度(P0.05)。结论： 1.AM表达TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4,在ALI时表达均增加；而TREM-2广泛表达于AM、成纤维细胞、支气管上皮细胞及肺泡Ⅱ型上皮细胞等多种肺系细胞,在ALI时表达降低。 2. TREM-2可抑制LPS应激的AM中NF-κB的活化,影响AM的激活,进而切断早期炎症的启动和放大。 3. TREM-2可抑制死亡受体和线粒体介导的凋亡通路,减少LPS应激的成纤维细胞的凋亡,维持成纤维细胞数量和功能的动态平衡,有利于受损肺组织的及时修复。 4.VIP可通过PKA和ERK信号传导通路上调核心转录因子AP1的表达,抑制NF-κB的活化,从而增加TREM-2的生成,参与肺组织的损伤修复。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R563.8

【参考文献】