HMGB1通过NF-κB激活TGF-β1诱导特发性肺纤维化发病机制的研究

发布时间：2018-04-18 15:19

  本文选题：特发性肺纤维化 + 高迁移率族蛋白B1　； 参考：《南京医科大学》2017年博士论文

【摘要】：目的:特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF)是一种致命性的肺病,该病病因不明,无特异的临床表现,早期诊断较困难,且临床上尚缺乏有效的治疗方法,导致其预后差、病死率高。作为一种核蛋白的高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)十分保守,有两种释放方式,一种主动释放,在炎症因子的刺激下,由巨噬细胞、垂体细胞、单核细胞等细胞主动分泌而释放;另一种是被动释放,当细胞坏死或凋亡时能够进行被动释放。HMGB1主要参与基因中DNA的转录、复制和修复,还能够导致炎症反应。HMGB1可诱导肺成纤维细胞增殖和肺泡上皮细胞发生上皮细胞间质转化(epithlial to mesenchymal transition,EMT),间质细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型胶原(collagenⅠ)表达增加,上皮细胞标志物E-钙黏蛋白表达减少。近年的研究显示:HMGB1信号的活化与肺纤维化发展密切相关,而阻断HMGB1信号可抑制其病理进程。但是其具体作用机制不清。体内有很多导致纤维化的细胞因子,其中转化生长因子β1(transforming growth factor beta,TGF-β1)是非常重要的一个致纤维化的细胞因子,能够诱导启动成纤维细胞开始分裂增殖,并且导致成纤维细胞能大量合成胶原蛋白,导致细胞外基质增多,肺间质最终发生胶原沉积等纤维化的组织病理学改变。目前有不少研究表明在肺纤维化的发生发展中,TGF-β1发挥着及其关键的作用。最近数年发现,核因子κB(NF-κB)作为转录因子家族中发现的新成员,是细胞内非常重要的核转录因子。当细胞受到刺激后,细胞内发生信号转导以及转录调控时,NF-κB在其中起着核心的作用,能够参与多种基因的表达和调控,标志着细胞已被激活。HMGB1与胞膜受体结合后会导致胞内信号转导,其中,胞膜受体主要有糖基化晚期终末产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)和 Toll 样受体(Toll-like receptor,TLR)。HMGB1与受体结合后,均能够活化NF-κB,NF-κB发生核内转移,进一步诱导下游多种基因的转录。结合TGF-β1基因序列分析结果,我们发现其启动子含有一个NF-κB结合位点,GGGACCCCCC。因此,我们有理由推论:胞外HMGB1通过与RAGE/TOLL受体结合,激活NF-κB,导致其细胞核内转移,与TGF-β1的启动子结合诱导TGF-β1大量表达,从而介导肺部成纤维细胞间质转化,最终促进IPF的发生发展。综上所述,对比HMGB1与TGF-β1的作用机制,本课题提出如下的科学假说:HMGB1通过激活NF-κB,导致其细胞核内转移,转录调控TGF-β1的表达,诱导肺成纤维细胞间质转化,进而控制IPF的发展进程。如果该推论成立,我们有望通过发现更多有效的分子靶点抑制肺泡上皮细胞的间质转化,控制IPF的发生发展。方法:①临床收集IPF患者正常肺组织和肺纤维化肺组织的标本,均采用HE染色,对比肺纤维化的程度;IPF患者正常肺组织和肺纤维化肺组织中HMGB1均采用免疫组化染色,对比HMGB1的表达量。②制备肺纤维化小鼠动物模型,采用免疫组化法对IPF小鼠正常肺组织和肺纤维化肺组织中HMGB1和TGF-β1进行染色,分别比较正常肺组织和肺纤维化肺组织中HMGB1蛋白表达量,以及TGF-β1的蛋白表达量。③HMGB1与人肺成纤维细胞株MRC-5共孵育,分别采用RT-PCR和Western Blot方法检测α-SMA和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表达量;采用ELISA方法检测细胞培养液中TGF-β1的蛋白表达量。④HMGB1与MRC-5共孵育过程中,加入TGF-β1中和性抗体,然后分别采用RT-PCR和Western Blot方法检测α-SMA和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表达量。⑤HMGB1与MRC-5共孵育,Western Blot方法检测NF-κB的蛋白表达量。⑥HMGB1与MRC-5共孵育过程中,加入NF-κB表达的抑制剂吡咯烷铵(PDTC),Western Blot 方法检测 TGF-β1、α-SMA 和 collagen Ⅰ的蛋白表达量。⑦HMGB1与MRC-5共孵育过程中,加入TGF-β1中和性抗体,Western Blot方法检测NF-κB的蛋白表达量。结果:①IPF患者正常肺组织和肺纤维化肺组织均采用HE染色,发现肺纤维化肺组织肺纤维化显著;IPF患者正常肺组织和肺纤维化肺组织中HMGB1均采用免疫组化染色,发现肺纤维化肺组织中HMGB1表达明显增多。②IPF小鼠正常肺组织和肺纤维化肺组织中HMGB1和TGF-β1均采用免疫组化法染色,结果发现,和正常肺组织相比,肺纤维化肺组织中HMGB1和TGF-β1表达均明显增多。③HMGB1与MRC-5共孵育,细胞中α-SMA和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表达量均增多;当 10ug/mL HMGB1 与 MRC-5 孵育 72h,细胞中 α-SMA 和 collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表达量达到高峰,且细胞培养液中TGF-β1的蛋白表达量达到高峰。④HMGB1与MRC-5共孵育过程中,加入TGF-β1封闭性抗体,细胞中α-SMA和collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表达量均减少。⑤HMGB1与MRC-5共孵育,细胞中NF-κB的蛋白表达量增多。⑥HMGB1与MRC-5共孵育过程中,加入PDTC后,细胞中TGF-β1、α-SMA和collagen Ⅰ的蛋白表达量均减少。⑦HMGB1与MRC-5共孵育过程中,加入TGF-β1封闭性抗体后,细胞中NF-κB的蛋白表达量未受影响。结论:本研究结果证实HMGB1通过影响NF-κB的表达,NF-κB激活后与TGF-β1的启动子结合,诱导TGF-β2的表达,促进肺成纤维细胞间质转化,进而促IPF进展。NF-κB是TGF-β1表达的上游调节基因,明确HMGB1促IPF进展的作用机制。由此,我们阐明HMGB1/NF-κB/TGF-β1信号通路活化在IPF进展中的作用分子机制,为寻找有效的靶点抑制IPF的进展提供坚实的理论依据,为临床治疗IPF带来新的思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R563

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本文编号：1768919