粒细胞型髓源抑制细胞在哮喘患者外周血水平及体外诱导分化机制研究

发布时间：2018-05-05 14:06

本文选题：G-MDSCs + 哮喘　；参考：《南方医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景髓源抑制细胞(MDSCs)由不成熟巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞等髓系细胞组成,其对T细胞功能有很强抑制作用。MDSCs可分为两种表型:粒细胞型(G-MDSCs)和单核细胞型(M-MDSCs),两者在细胞增殖及免疫抑制功能机制上不尽相同。我们前期研究在哮喘动物模型中发现MDSCs参与了哮喘发生与发展。在给哮喘小鼠过继转移脂多糖诱导的不同表型MDSCs发现:G-MDSCs能减轻气道炎症。那么,G-MDSCs在哮喘急性期及临床缓解期患者外周血分布情况如何?是否与哮喘气道炎症的发生有关?本研究在前期动物实验基础上,拟进一步探讨其在哮喘患者外周血所占比例情况,为G-MDSCs作为哮喘急性发作临床指标做初步探索。近来,MDSCs因可进行体内诱导、体外扩增、自体和异体移植而日益成为免疫治疗关注的热点,但体外诱导效率较低及较难获得单一表型MDSCs大大限制其临床应用。课题组前期虽已成功用LPS体内诱导MDSCs生成,但诱导成功后需进一步分离提纯,步骤复杂。如前所述,我们已经探讨G-MDSCs与哮喘小鼠气道炎症关系及其在哮喘患者外周血情况。那么,为了进一步阐明其在哮喘中的作用,并用于哮喘等免疫性疾病的治疗,建立高效G-MDSCs体外诱导体系值得研究。因此,本研究拟采用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)体外定向诱导G-MDSCs,寻找体外诱导纯化的最佳条件,同时探索诱导信号通路,为建立有效的G-MDSCs诱导体系及推进其临床应用打下基础。第一部分G-MDSCs在哮喘患者外周血水平观察目的研究哮喘患者外周血MDSCs及其不同表型G-MDSCs和M-MDSCs所占比例情况。方法收集就诊于南方医科大学珠江医院33例哮喘急性期患者,16例缓解期哮喘患者和15例健康对照者外周静脉血5ml;将血标本处理后用抗体标记,流式细胞仪检测MDSCs及其不同表型所占比例。结果1.三组 FeNO、PEF、MMEF%pred、MEF75%pred 和 MEF50%pred 差异有统计学意义(均P0.05)。2.MDSCs占外周血单个核细胞比例在急性期哮喘组中最高,三组差异有统计学意义(P=0.003),而G-MDSCs及M-MDSCs所占比例无统计学差异(均P0.05)。3.各组G-MDSCs所占比例均高于M-MDSCs,且差异均有统计学意义(均P0.05)。结论MDSCs占外周血单核细胞比例在急性期哮喘组最高,而其不同表型并无差异。G-MDSCs在哮喘患者或是正常人中均为主要表型。第二部分G-MDSCs体外诱导分化条件及免疫抑制功能研究目的探讨G-CSF体外诱导骨髓细胞定向分化成G-MDSCs适宜条件及其对T细胞免疫抑制功能研究。方法于BALB/c小鼠无菌获取骨髓细胞,利用GM-CSF联合不同浓度梯度G-CSF,加或不加脂多糖(LPS)体外刺激骨髓细胞,在不同时间点用流式检测MDSCs及其不同表型所占比例;用不同浓度GM-CSF加或不加G-CSF刺激骨髓细胞,流式检测G-MDSCs比例;用诱导分化MDSCs与CFSE标记淋巴细胞共培养,流式检测淋巴细胞增殖率。结果1.随G-CSF浓度增加,G-MDSCs所占比例明显增加,各组之间差异有统计学意义(P=0.001),G-CSF(50ng/ml)为最适浓度,且第5天增多最为明显(均P0.001)。2.G-CSF联合LPS组G-MDSCs比例较无LPS组减少(均P0.05)。3.MDSCs与T细胞共培养组较无MDSCs组T细胞增值率下降(均P0.05)。结论G-CSF体外可诱导MDSCs生成,且促进G-MDSCs表型分化,50ng/ml G-CSF刺激时间5天为适宜诱导条件,诱导生成的MDSCs具有免疫抑制功能。第三部分G-CSF体外定向诱导G-MDSCs信号通路机制研究目的探讨G-CSF体外诱导骨髓细胞定向分化成G-MDSCs信号通路。方法不同浓度梯度G-CSF(0,5,10,50,100ng/ml)刺激骨髓细胞,3-5天后收集细胞,分别提取核酸及蛋白,用RT-PCR和Western blot检测STAT3、C/EBPβ表达量。结果1.STAT3和C/EBP β mRNA表达情况:各组STAT3 mRNA表达量无明显区别(P00.24),C/EBP β在各组表达量差异有统计学意义(P=0.002),除5ng/ml组以外,其余较对照组均有显著增加,50ng/ml组最明显(P0.001,P0.001,P=0.003 和 P=0.001)。2.STAT3和C/EBP β蛋白表达情况:总STAT3在各组无明显差异(P=0.739),p-STAT3随剂量增加而上升,其中50ng/ml组最显著(均P0.001)。C/EBPβ及p-C/EBPβ在各组差异均有统计学意义(P=0.018和P=0.03),50ng/ml组升高最为明显。结论p-STAT3与p-C/EBPβ表达量随浓度增高增加,且两者变化趋势相同,G-CSF可能是通过STAT3/C/EBPβ日信号通路调控G-MDSCs定向分化。
[Abstract]:In order to further clarify the role of G - MDSCs in the pathogenesis of asthma , it was found that G - MDSCs were involved in the pathogenesis and development of asthma . The results showed that G - CSF could induce MDSCs to differentiate into G - MDSCs in vitro . The results showed that G - CSF could induce MDSCs to differentiate into G - MDSCs .

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R562.25

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