Hrd1在香烟烟雾诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞内质网应激中的作用

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《南华大学》 2012年

Hrd1在香烟烟雾诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞内质网应激中的作用

姜迪譞  

【摘要】：目的：观察原代培养的大鼠II型肺泡上皮细胞（AECII）暴露于香烟烟雾提取物（CSE）不同时间凋亡率的变化，以及AECII中Hrd1、内质网应激（ERS）相关因子、ERS诱导性凋亡相关因子的表达变化；观察Hrd1基因沉默/过表达对上述变化的影响；探索Hrd1在COPD关于肺结构细胞凋亡的发病机制中所起的作用。 方法：原代及传代培养大鼠AECII；制备CSE；用携带Hrd1干扰序列/编码序列的慢病毒侵染AECII沉默/过表达Hrd1基因；在10%CSE刺激AECII的0h、3h、6h、12h、24h、48h时间点：Hoechst染色检测干预前后细胞凋亡率、Realtime-PCR、Western blot技术检测干预前后Hrd1、PERK、P-PERK、eIF2α、P-eIF2α、IRE1、P-IRE1、ATF6、caspase12、JNK、P-JNK、CHOP的表达； 结果： 1.传至第3代培养的细胞，其形态、生长特征及生理学特性与原代培养细胞无明显差异。 2. Hoechst染色显示：暴露于10%CSE的大鼠AECII其凋亡率随着刺激时间的延长不断升高；敲除Hrd1基因组细胞各时间点凋亡率较野生型明显增加；过表达Hrd1基因组细胞凋亡率较野生型明显降低。 3.Westen blot结果显示：10%CSE作用不同时间PERK、eIF2α以及IRE1总蛋白的表达差异无统计学意义（P＞0.5），野生型细胞P-PERK的表达从3h组开始升高，12h达到高峰，后逐渐降低但仍高于对照组水平，P-eIF2α随着CSE暴露时间的延长呈递增趋势；沉默Hrd1基因后，P-PERK的表达从3h组有所升高，6h开始即表达稍降并随着CSE作用时间的延长显著降低，而P-eIF2α蛋白的表达则随着作用时间的延长呈持续下降趋势；过表达Hrd1基因后，P-PERK蛋白的表达随着作用时间的延长不断减少，而P-eIF2α的表达从3h组稍有升高，12h组最高，随后根据CSE作用时间的延长显著降低。野生组P-IRE1的表达随着CSE暴露时间的延长呈递增趋势；沉默组P-IRE1的表达从3h开始逐渐升高，12h达高峰，24h、48h表达均下降；过表达组P-IRE1的表达随着作用时间的延长不断增加。野生组ATF6α的表达随着CSE暴露时间的延长呈递增趋势；沉默组ATF6α蛋白的表达则随着作用时间的延长呈持续下降趋势；过表达组ATF6α的表达从3h开始逐渐降低，6h最低，12h开始表达增加并在24h、48组持续增加。 4. Westen blot结果显示：10%CSE作用不同时间总JNK蛋白的表达与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.5），P-JNK的表达随着CSE暴露时间的延长呈递增趋势，caspase12的表达从3h组开始升高，12h达到高峰，随后逐渐降低但仍高于对照组水平。CHOP蛋白的表达在野生组随着CSE暴露时间的延长不断增加，在沉默组从3h组开始升高，12h达最高峰，之后随着CSE作用时间的延长逐渐下降但表达始终高于对照组，在过表达组随着CSE作用时间的延长持续升高。 结论： 1.在适宜的培养条件下，离体培养的第3代AECⅡ能够维持相对稳定的分化表型，可以用于探索在体AECII的凋亡机制。 2. CSE能够诱导AECII发生ERS并通过ERS介导细胞凋亡，PEAK/IRE1/ATF6三条跨膜信号通路均参与了CSE诱导的ERS，，Caspase12/JNK/CHOP三条ERS凋亡信号通路均参与介导CSE诱导的AECII凋亡。 3. Hrd1对CSE诱导的AECII凋亡具有保护作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R563.9
【目录】：

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