miRNA-142-3p对肺泡巨噬细胞炎症过程负向调控研究

发布时间：2018-07-12 22:09

本文选题：肺泡巨噬细胞 + 脂多糖　；参考：《第二军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一种临床上常见的危重病,是各种因素导致的进行性的急性呼吸衰竭,临床特征是顽固性低氧血症,ARDS主要是肺内严重的炎症反应引起肺泡细胞的屏障被破坏,大量的炎性细胞如中性粒细胞等大量涌入肺泡内,而这些炎性细胞能释放大量炎性介质和细胞毒性物质,从而造成肺泡内富含蛋白质的液体聚集,Ⅱ型肺泡上皮细胞表面活性物质损害,影响肺的换气功能。因为ARDS是临床上一类发病率和死亡率都较高的综合征,因此对ARDS的研究一直是热门,虽然经过多年研究,但发病机制仍不明确,有效的治疗手段缺乏,基础研究和临床应用仍有很多问题待解决。miRNA作为非编码RNA一员,在体内的主要作用是调控基因的表达,miRNA能调控多种信号通路和细胞的分化增值过程,因此与许多正常和异常的病理生理过程密切相关,参与许多疾病的发生发展。大量研究发现,多种miRNA(如miR-146a、miR-155、miR-16等)与ARDS的进展和转归密切相关。高迁徙族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)作为研究热门的炎症因子,其在炎症反应中升高较其他炎性因子晚,但持续时间长,在炎症反应中起到重要作用。HMGB1可通过多种细胞信号通路(如TLRs、RAGE、cPKC等通路)参与炎症反应,而miRNA能参与调节多种信号通路。因此,我们进行此实验,以探究miR-142-3p对脂多糖诱导的大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应的干预作用,可能会进一步完善ARDS诊断中的生物学标记及分子学的治疗手段,为ARDS的诊疗提供新方向。第一部分LPS诱导肺泡巨噬细胞炎症中mi R-142-3P与HMGB1表达水平的研究目的探讨miR-142-3P与HMGB1均参与LPS诱导肺泡巨噬细胞炎症反应。方法通过体外培养NR8383细胞,加入含不同浓度(0、100、1000、10000mg/mL)的LPS分别刺激0h、6h、24h、48h,收集不同浓度不同时间点的上清液和细胞。细胞提取RNA,蛋白质印迹法检测细胞中HMGB1蛋白的表达水平,RT-qPCR检测细胞中miR-142-3p及炎症因子的表达量,ELISA检测上清液中HMGB1的含量。结果与未受到LPS刺激的细胞(即0 ng/mL组)相比,大鼠肺泡巨噬细胞通过100ng/mL、1000 ng/mL、10000ng/mL的LPS刺激后,细胞中的TNF-α、IL-6、IL-1β的表达量明显增加,差异具有统计学意义(P0.05),100 ng/ml的LPS能够有效刺激各种炎症因子的表达,差异具有统计学意义(P0.05)。miR-142-3p在LPS刺激后表达量较对照组增多,在48 h达到高峰,差异具有统计学意义(P0.05);HMGB1的表达量至24 h达到高峰,而至48 h时HMGB1的表达又下降到一定水平,差异具有统计学意义(P0.05)。结论100ng/mL的LPS能有效刺激肺泡巨噬细胞的炎症反应过程。miR-142-3p和HMGB1均参与了LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应过程,且两者可能存在调控关系。第二部分miR-142-3p通过HMGB1负向调控LPS诱导的大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应过程目的探讨LPS诱导肺泡巨噬细胞炎症中miRNA-142-3p对HMGB1表达水平的调控作用。方法体外培养NR8383细胞,不同浓度的miRNA-142-3p minics分别转染大鼠肺泡巨噬细胞24h,分别收集不同minics浓度转染组细胞一孔,RT-qPCR检测细胞中miR-142-3p的表达量,剩余孔细胞加入100ng/ml的LPS刺激0h、6h、24h、48h后,收集不同浓度不同时间点的上清液和细胞。细胞提取RNA,RT-qPCR检测细胞中miR-142-3p及炎症因子的表达量,ELISA检测上清液中HMGB1的含量。结果大鼠AM NR8383细胞转染miR-142-3p mimics后,检测NR8383细胞中miR-142-3p表达量,结果显示,与未转染组相比,转染miR-142-3p mimic后,NR8383细胞中miR-142-3p的表达量明显升高(P0.05)。在大鼠AM NR8383细胞转染miR-142-3p mimics后,检测NR8383细胞中HMGB1 mRNA的表达水平和细胞培养液及细胞中HMGB1的蛋白表达。结果显示,转染miR-142-3p mimic后,NR8383细胞中miR-142-3p的表达升高(P0.05),而HMGB1 mRNA及蛋白的表达均降低(P0.05)。转染miR-142-3p mimics 24 h后,LPS诱导AM0、6、24、48 h时,ELISA试剂盒分别检测转染组和未转染组上清中HMGB1的表达量。结果显示,培养0、6、24 h时miR-142-3p mimic转染组中HMGB1的含量均低于未转染组(P0.05)。大鼠AM转染miR-142-3p mimics后,LPS诱导AM 0、6、24、48 h时,qPCR检测AM中TNF-α、IL-6、IL-1β和MIP-2βmRNA的表达水平。结果(图6)显示,与未转染组相比,转染miR-142-3p mimic后NR8383细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β以及MIP-2βmRNA的表达均降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论LPS体外诱导大鼠AM的炎症反应过程中,miR-142-3p可能是通过负向调控HMGB1的表达发挥对炎症反应的干预作用。
[Abstract]:Acute respiratory distress syndrome ( ARDS ) is a common type of acute respiratory failure , which is a common type of acute respiratory failure due to various factors . The expression of miR - 142 - 3P in NR8383 cells was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . The expression of miR - 142 - 3P in NR8383 cells was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . Results ( FIG . 6 ) showed that the expression of TNF - 伪 , IL - 6 , IL - 1尾 and MIP - 2尾 mRNA in the transfected group was lower than that in untransfected group ( P0.05 ) .
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R563.8

【参考文献】