【摘要】：第一部分大鼠COPD模型建立及干预 背景和目的： 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种以气流受限为特征的慢性气道疾病,同时也是一种涉及多器官受损的全身疾病。近年来国内外研究发现,部分运动受限的COPD患者表现为明显的骨骼肌功能障碍。对中、重度COPD患者,骨骼肌的消耗成为预计患者病死率的重要指标之一。 COPD的骨骼肌功能障碍形成机制复杂,系统性炎症在COPD患者中的存在已被广泛接受,有人认为炎症是COPD患者骨骼肌功能障碍的始动因素。其中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)作为一种重要炎症介质已被证明参与了COPD的炎症过程。 线粒体是骨骼肌运动所需能量的生成场所,也是活性氧(ROS)产生的主要场所,同时也处于细胞凋亡的中心环节。因此,线粒体功能障碍在COPD的骨骼肌功能障碍中越来越受到重视。已有研究发现,中重度COPD患者出现运动性骨骼肌萎缩、骨骼肌线粒体密度减少及结构异常。 我们拟通过建立COPD大鼠模型,观察COPD模型大鼠骨骼肌形态学变化及电镜下骨骼肌纤维与线粒体变化,同时给予白藜芦醇及AMP激活的蛋白激酶(Adenosine5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)激动剂干预。评估外周血及骨骼肌TNF-a水平与骨骼肌与线粒体的结构形态改变的关系,为炎症在COPD骨骼肌功能障碍中的损伤作用机制提供实验依据。 方法： 1.COPD大鼠模型制备用两次气管内注入脂多糖(LPS)和反复烟熏的方法制作COPD大鼠模型。 2.分组与处理雄性SD大鼠随机分为对照组、COPD模型组、AICAR (AMPK特异性激动剂)组和白藜芦醇组,对照组和模型组分别给予生理盐水、AICAR、白藜芦醇。 3.肺功能采用无束缚小动物肺功能仪(Buxco, USA)测定大鼠肺功能变化。 4.肺和骨骼肌病理采用HE、Masson染色光学显微镜下观察各组肺脏和骨骼肌的病理变化。及电镜观察骨骼肌与线粒体的超微结构改变。 结果： 1.各实验组大鼠行为变化模型组及各治疗组大鼠早期出现躁动不安、咳嗽、气急、、进食进水量逐渐减少等表现。正常对照组则始终未见上述表现。各组体重改变差异无显著性。 2.各实验组大鼠肺功能变化与对照组比较,模型组大鼠PEF明显降低(P0.01),VT明显降低(P0.05),EF50明显降低(P0.05)。AICAR和白藜芦醇组PEF、均较模型组明显升高(P0.05,P0.01)。AICAR和白藜芦醇组VT均较模型组明显升高、EF50(P0.05)。AICAR和白藜芦醇组EF50均较模型组明显升高(P0.05)AICAR和白藜芦醇组间比较差异无统计学意义(P0.05)。 3.大鼠肺组织病理变化COPD模型组可见广泛肺泡壁增厚、破坏,肺泡破裂、融合,小气道纤毛脱落,气腔狭窄,小血管壁增厚。AICAR组肺组织可见中量炎症细胞浸润,肺泡壁破坏、肺泡融合,肺泡腔增大；白藜芦醇组肺组织可见中量炎症细胞浸润,肺泡壁破坏、小气道纤毛脱落,气腔狭窄。 4.骨骼肌细胞形态学观察COPD模型组大鼠骨骼肌细胞轻度萎缩,胶原纤维沉积较对照组明显增多。白藜芦醇和AICAR组大鼠组骨骼肌细胞较COPD模型组大鼠胶原纤维沉积减少。透射电镜下观察显示：模型组大鼠的小腿三头肌线粒体减少,出现肿胀,水性变及空泡化,内膜、嵴破坏溶解改变；白藜芦醇组及AICAR组大鼠的小腿三头肌线粒体结构尚完整,肌丝完整,肌原纤维排列整齐,分布正常。 结论： 1.两次气管内注入脂多糖(LPS)和反复烟熏的方法可成功制作COPD大鼠模型。 2. COPD模型大鼠骨骼肌存在骨骼肌炎症及线粒体损伤。 3. AICAR及白藜芦醇可以改善COPD模型大鼠骨骼肌炎症反应,减轻线粒体结构损伤。 第二部分AMPK对COPD大鼠骨骼肌线粒体合成调控中的作用及白藜芦醇作用机制探讨 背景和目的： 近年来国内外研究发现,部分运动受限的COPD患者表现为明显的骨骼肌功能障碍。COPD的骨骼肌功能障碍形成机制复杂,系统性炎症在COPD患者中的存在已被广泛接受,TNF-α作为一种重要炎症介质已被证明参与了COPD的炎症过程。 AMPK作为真核生物细胞中一个重要的蛋白激酶,参与细胞的能量代谢过程,其通过调控代谢相关酶起作用。国内外研究发现AMPK的下游靶蛋白参与能量代谢调节有关。但是AMPK是否参与炎症介导的COPD骨骼肌线粒体生物合成障碍目前一无所知。 本研究拟通过观察大鼠外周血与骨骼肌TNF-α水平、骨骼肌AMPK表达、PGC-1α及线粒体生物合成相关基因表达的变化,进而探讨炎症状态下COPD模型大鼠骨骼肌线粒体合成的的影响,同时给予AMPK激动剂及白藜芦醇干预后观察PGC-1α变化及对骨骼肌线粒体生物合成的影响,为治疗COPD骨骼肌障碍提供新的理论基础。 方法： 1. COPD大鼠模型制备与分组与处理同第一部分。 2.取材与处理采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清TNF-a浓度；小腿三头肌留取组织匀浆,取上清液采用ELISA法检测TNF-a浓度；采用荧光定量PCR分析检测AMPK、NRF-1、PGC-1α、Tfam、COX ⅣmRNA表达；采用Western blotting检测AMPK, TNF-α PGC-1α Tfam、COX Ⅳ蛋白表达。 结果： 1.不同组别血清TNF-α的水平与对照组比较,模型组大鼠血清TNF-a明显升高,组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显降低,组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组间无显著统计学差异,组间比较差异无统计学意义(P0.05)。 2.不同组别骨骼肌TNF-α的水平与对照组比较,模型组大鼠骨骼肌TNFa明显升高,组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显降低,组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。AICAR组骨骼肌TNFa明显低于白藜芦醇组,组间比较差异无统计学意义(P0.05)。 3.不同组别骨骼肌AMPK mRNA及蛋白表达的变化与对照组比较,模型组大鼠骨骼肌AMPK mRNA相对含量明显降低,组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显升高(组间比较差异具有统计学意义P0.01)。AICAR组AMPK mRNA相对含量明显高于白藜芦醇组,组间比较差异无统计学意义(P0.01)。与对照组比较,模型组大鼠骨骼肌AMPK蛋白相对含量明显降低,组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显升高,组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。白藜芦醇组AMPK蛋白相对含量明显低于AICAR组,组间比较差异具有统计学意义(P0.05)。 4.不同组别骨骼肌PGC-1a mRNA及蛋白表达的变化与对照组比较,模型组大鼠骨骼肌PGC-1amRNA(?)目对含量明显降低,组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显升高,组间比较差异具有统计学意义(P0.05)。AICAR组与白藜芦醇组间无明显统计学差异,组间比较差异无统计学意义(P0.05)。与对照组比较,模型组大鼠骨骼肌PGCla蛋白相对含量明显降低,组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显升高,组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。白藜芦醇组PGC1a蛋白相对含量明显高于AICAR组,组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。 5.不同组别骨骼肌NRF-1mRNA及蛋白表达的变化与对照组比较,模型组大鼠骨骼肌NRF1mRNA明显降低(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显升高(P0.05)。AICAR组与白藜芦醇组间无明显统计学差异(P0.05)。与对照组比较,模型组大鼠骨骼肌NRF1蛋白明显降低(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显升高(P0.01)。白藜芦醇组NRF1蛋白明显高于AICAR组(P0.01)。 6.不同组别骨骼肌Tfam mRNA及蛋白表达的变化与对照组比较,模型组大鼠骨骼肌Tfam mRNA明显降低(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显升高(P0.05,P0.01)。AICAR组与白藜芦醇组间无明显统计学差异(P0.05)。与对照组比较,模型组大鼠骨骼肌Tfam蛋白明显降低(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显升高(P0.01)。白藜芦醇组Tfam蛋白明显高于AICAR组(P0.01)。7.不同组别骨骼肌COX Ⅳ mRNA及蛋白表达的变化与对照组比较,模型组大鼠骨骼肌COXIVmRNA明显降低(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显升高(P0.05)。AICAR组与白藜芦醇组间无明显统计学差异(P0.05)。与对照组比较,模型组大鼠骨骼肌COX Ⅳ蛋白明显降低(P0.01)。AICAR和白藜芦醇组均较模型组明显升高(P0.01)。白藜芦醇组COX Ⅳ蛋白明显高于AICAR组(P0.01)。 8.相关性分析骨骼肌TNF-a和AMPK呈负相关关系(R=-0.454,P0.01)。骨骼肌PGC-1a mRNA和AMPKmRNA呈正相关关系(R=0.278,P0.05)。骨骼肌TNF-a和PGC-1amRNA呈负相关关系(R=-0.780,P0.01)。骨骼肌PGC-1a mRNA和NRFmRNA呈正相关关系(R=0.685,P0.01)。骨骼肌PGC-1a mRNA和Tfam mRNA呈正相关关系(R=0.800,P0.01)。 结论： 1. COPD大鼠骨骼肌存在TNF-α介导的炎症。 2. COPD大鼠骨骼肌AMPK水平下降,PGC-1α表达下降影响骨骼肌线粒体生物合成。 3. AMPK激动剂AICAR及白藜芦醇可通过活化AMPK,提高PGC-1α表达水平,改善了COPD运动性骨骼肌线粒体生物合成。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R563
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本文编号：
2280870
