【摘要】：目的：本研究使用博来霉素建立C57BL/6小鼠的肺纤维化模型,原代培养出肺成纤维细胞,MTT法筛选出活性最强的陈皮生物碱,观察陈皮生物碱对C57BL/6小鼠肺纤维化的早期干预作用,并探讨其对PGE2通路的影响。方法：1.将C 57BL/6小鼠每组10只,随机分成正常组和模型组,利用博来霉素制备C57BL/6小鼠肺纤维化模型,通过原代培养获得小鼠的肺成纤维细胞。2.将小鼠肺成纤维细胞进行传代,用处在对数生长期的肺成纤维细胞进行实验。采用四氮唑盐比色法(MTT法)对陈皮生物碱在20μM浓度下进行初筛,其次设5个浓度复筛,分别是5OμM、25μM、2.5μM、6.2525μM、3.12525μM五个浓度梯度；用乳酸脱氢酶(LDH)实验来检测陈皮生物碱对小鼠肺成纤维细胞的毒性；筛选出活性最强的陈皮生物碱。3.C57BL/6小鼠随机分为正常组、博来霉素组(模型组)、陈皮生物碱高剂量组(100mg/kg)、陈皮生物碱中剂量组(50mg/kg)、陈皮生物碱低剂量组(25mg/kg)、阳性对照组(强的松组)；正常组除外,其余各组均采用BLM (5mg/kg)气管内滴注制备肺纤维化模型；造模后第1天开始灌胃小鼠,每天按剂量灌胃一次,连续28天；正常组和模型组按100mg/kg生理盐水灌胃；陈皮生物碱组按高、中、低剂量每天灌胃1次；阳性组按6mg/kg强的松灌服。给药第28天时处死小鼠,取肺组织行HE染色及Masson染色观察病理变化；按试剂盒说明检测小鼠肺组织中羟脯氨酸(HYP)的含量；用Elisa法测血清中的转化生长因子(TGF-β1)及肺组织中前列腺素E2 (PGE2)的含量；蛋白印迹法(Western blotting)检测肺组织中TGF-β1 COX-2 及 G-蛋白偶联的跨膜受体2(E-series of prostaglandin receptor, EP2)的蛋白表达水平。结果：1.光学显微镜下原代培养的小鼠肺成纤维细胞呈长条形或梭形,平行地排列生长；经波形蛋白(Vimentin)及a-平滑肌蛋白(a-SMA)免疫细胞化学染色鉴定后,、imentin及α-SMA蛋白均表达于胞质,均呈黄棕色,证实所培养的细胞为成纤维细胞；运用MTT法测出肺成纤维细胞的生长曲线：48h的时候进入对数生长期,72-96h为细胞的对数生长期,120h后细胞生长处于高峰期,然后进入平台期。2.体外试验：陈皮生物碱及其盐对小鼠肺成纤维细胞均有抑制作用,其中对羟基苯乙胺盐的抑制效果最强；LDH实验显示对羟基苯乙胺盐对肺成纤维细胞的增殖抑制作用是其药物活性并非其毒性。3.小鼠体重变化：(1)模型组小鼠体重增长速度显著慢于正常组,并且体重比正常组有着明显的减轻,(P0.01)(2)与模型组比较,高剂量组、中剂量组、低剂量组及强的松组的体重是增加的,但没有显著性。4.肺泡炎及肺纤维化积分：(1)模型组在肺泡炎程度及肺纤维化程度方面均高于正常组,差异具有统计学的意义(P0.01)。(2)与模型组比较,高剂量组和强的松组在肺泡炎和肺纤维化程度方面均较模型组轻,差异是有统计学意义(P0.05或P0.01),中剂量组及低剂量组在肺泡炎方面较模型组有显著性的减轻(P0.05)。5.HYP含量：模型组小鼠肺组织中的HYP含量较正常组显著性升高的(P0.01)；与模型组比较,高剂量组、中剂量组及强的松组小鼠肺组织中HYP含量有着显著性下降(P0.05或P0.01)。6.血清中TGF-β1含量：模型组小鼠血清中TGF-β1含量比正常组显著增高(P0.01)；与模型组相比,高剂量组、中剂量组及强的松组小鼠血清中TGF-β1含量是显著下降的(P0.05或P0.01)。7.肺组织中PGE2含量：模型组小鼠肺组织中的PGE2含量和正常组比较,显著升高(P0.01)；与模型组比较,高剂量组小鼠肺组织中PGE2含量显著增加(P0.05)。8.Western blotting检测结果：与正常组比较,模型组小鼠肺组织中TGF-β1的蛋白表达显著增高(P0.05),模型组肺组织中COX-2及EP2的表达与正常组比较,显著增加(P0.05)；高剂量组及中剂量组肺组织中的TGF-β1的蛋白表达水平显著低于模型组(P0.05),高剂量的对羟基苯乙胺盐可以提高小鼠肺组织中COX-2及EP2的蛋白表达,有显著性(P0.05)。结论：1.用胰蛋白酶消化法可以分离出肺纤维化肺成纤维细胞,能够满足实验需要,但培养时间较长；并且培养出来的肺成纤维细胞具有肌成纤维细胞的特性,可用于肺纤维化机制的研究。2.陈皮生物碱在体外对小鼠肺成纤维细胞均有较好的抑制其增殖的作用,其中对羟基苯乙胺盐的抑制作用最好,其对小鼠肺成纤维细胞的抑制作用是其生物活性,并非其毒性。3.对羟基苯乙胺盐能够改善肺纤维化小鼠的症状及增加其体重。4.对羟基苯乙胺盐对BLM诱导的PF小鼠的肺泡炎及肺纤维化程度能起到一定的缓解作用。5.对羟基苯乙胺盐可以降低PF小鼠肺组织中的HYP含量,同时还可以使PF小鼠血清和肺组织中TGF-β1的含量降低,具有一定的早期干预肺纤维化作用；可以增加PF小鼠肺组织中COX-2、PGE2及EP2的蛋白表达,其可能通过PGE2通路起到早期干预肺纤维化的作用。6.本实验结果显示对羟基苯乙胺盐可能作为一种新的药物早期干预IPF。
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【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563
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本文编号：2285613
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